Estudos estruturais e funcionais do fator inibitório da migração dos macrófagos de Leishmania major (LmMIF2) e de mutantes da região Carboxi-terminal

• Autor(a) principal: Cunha, Elise Marques Freire
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-04032022-142834/
• topic: Análise estrutural em solução; Análise estrutural em solução; Fator inibitório de migração de macrófagos; Fator inibitório de migração de macrófagos; Leishmania major; Leishmania major; Manipulação genética; Manipulação genética; Virulência; Virulência

O Fator Inibitório da Migração dos Macrófagos (MIF) é uma importante proteína pró-inflamatória e imunoreguladora que contribui para a patogenicidade de várias doenças, havendo uma correlação entre os níveis de MIF e a severidade dessas patologias. Ortólogos do MIF foram descritos em diversas espécies patogênicas ao homem, sugerindo que a produção desses ortólogos, por parasitas, tenha a função de modular a resposta imune, promovendo a sobrevivência dos parasitas no hospedeiro. O mapeamento do genoma de L. major revelou dois lócus gênicos (MIF1 e MIF2) que apresentaram uma significativa identidade com a MIF de mamíferos. Dessa forma, a caracterização estrutural e funcional de MIF2 de L. major pode contribuir para elucidar os aspectos envolvidos no mecanismo adotado pela Leishmania para evadir do sistema imune do hospedeiro, uma vez que já foi sugerido uma modulação do sistema imunológico do hospedeiros por outros parasitos que expressam MIF durante seu ciclo de vida. Neste trabalho, foi realizada caracterização estrutural em solução da MIF2 de L. major e de mutantes com deleções de 05 e 10 aminoácidos na cauda C-terminal. MIF2 de L. major e os mutantes W108F-&Delta;5, W66L-&Delta;5 e MIF2-&Delta;10 foram expressas em E. coli, purificadas do extrato solúvel por cromatografia de afinidade e detectada por SEC-MALS como trímero em solução (pH 7 e 4). As análises de CD UV-distante mostram que as deleções na cauda C-terminal não ocasionaram alterações na estrutura secundária em relação à MIF2 e que as proteínas mantém sua estrutura secundária estável até extremos de pH, sugerindo comportamento de glóbulo fundido. Com relação à estrutura terciária, CD de UV-próximo em pH 7 mostra que a deleção na cauda C-terminal da MIF2 ocasionou alterações no microambiente do triptofano. Esses dados foram confirmados pelas análises de fluorescência que mostraram que W108F-&Delta;5, W66L-&Delta;5 e MIF2-&Delta;10 apresentaram deslocamento de &lambda;máximo para a região do vermelho, indicando ambiente mais polar para este aminoácido. É possível observar para os mutantes W108F-&Delta;5 e MIF2-&Delta;10 uma intensidade de fluorescência semelhante a da MIF2. O mutante W66L-&Delta;5 apresentou uma intensidade de fluorescência cerca de 50% menor do que a MIF2 recombinante evidenciando maior contribuição do W108 para a fluorescência da proteína. Espectros de fluorescência do ANS reforçam os resultados a respeito da existência de um estado de glóbulo fundido, uma vez que, tanto MIF quanto mutantes, apresentaram mudanças na estrutura terciária em pHs mais ácidos (< 4,0). Os experimentos de Dicroísmo Circular utilizando concentrações de GdnHCl (0 - 6M) demonstram que a mutação de 10 aminoácidos na cauda C-terminal diminui a estabilidade da proteína. Os mutantes com 5 aminoácidos deletados na cauda C-terminal possuem estabilidade similar à MIF2 recombinante. Ensaios de migração de macrófagos in vitro mostraram que as deleções na cauda C-terminal não influenciaram na atividade das proteínas, mostrando que esta região não é essencial para a atividade de MIF2. O nocaute gênico de MIF2 e MIFs foi obtido por CRISPR/Cas9. As cepas reexpressoras de MIF2 e mutantes MIF2&Delta;5 e MIF2&Delta;10 apresentaram crescimento similar à linhagem L. major Friedlin Cas9/T7 e da linhagem parental com o vetor pX63NEO vazio, mostrando que a reinserção de MIF2 e MIF mutada, mesmo que epissomal, restabeleceu a capacidade de replicarse em cultura. O superexpressor de MIF2 epissomal teve sua virulência diminuída quando comparada a linhagem parental pX63NEO vazio e a expressão dos mutantes MIF2&Delta;5 e MIF2&Delta;10 epissomal reverteram esse efeito. Os parasitas nocauteados de MIF2 e MIFs afetaram o crescimento do parasito em cultura e diminuíram cerca de 70% da virulência durante a infecção in vitro e in vivo e a região Cterminal está envolvida na modulação desta virulência.