Caracterização molecular do gene da delta-endotoxina sua clonagem e transformação em Bacillus thuringienn sis (Berliner)

• Autor(a) principal: Arantes, Olivia Marcia Nagy
• Data de Publicação: 1989
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20200111-134027/
• topic: BACTÉRIAS ENTOMOPATOGÊNICAS; CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR; GENES; PLASMÍDEOS; TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA; VETOR DE CLONAGEM

A partir de um novo isolado de Bacillus thuringiensis, SPL407 (serotipo H1), detectou-se o gene da delta-endotoxina, usando DNA total, com o auxílio de sondas moleculares. Este gene foi inserido em dois vetores. A princípp io no pUC18, originando o plasmídio pHT407, e depois no pHT3101, um novo vetor, construído na tentativa de se obter expressão e estabilidade em Bacillus thuringiensis, originando o pHT408. O pHT409 e o pHT410 são o pHT408 deletado de 5 kb naa região vizinha ao gene cry clonado em orientações diferentes em relação ao promotor lac Z do pUC18 (pHT409, orientação oposta e pHT410 a mesma orientação). Os quatro novos plasmídios foram introduzidos em E. coli por traa nsformação clássica e o s plasmídios construídos a partir do pHT3101 introduzidos em Bacillus thuringiensis var KurstakiHD1Cry B por eletroporação. A expressão do gene cry ocorreu nas duas espécies. Entretanto, por razõess desconhecidas, em E.coli o pHT410 não se expressou tão bem quanto o pHT408 e o pHT409. No início da fase estacionária de B. thuringiensis, onde normalmente a bactéria não produz a delta-endotoxina, o clone pHT410 sintetiza este poll ipeptídio, provavelmente devido a diferenças no comportamento do promotor lac. Através do Western blotting e imunodetecção, verificou-se que o gene clonado do tipo cryIAa produz um polipeptídio de 130 kDa, que se expressa fracamente na linn hagem parental (SPL 407) que por sua vez produz um polipeptídio de 140kDa, mostrando que nesta linhagem coexistem, no mínimo, dois genes da delta -endotoxina ativa sobre Lepidoptera que se expressam diversamente. Este resultado pode ser devido a difee renças no número de cópias do gene ou na eficiência do promotor.