Nanopartículas híbridas polímero-lipídicas associadas à internalização fotoquímica para liberação de siRNA na terapia tópica da psoríase
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2020 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
Texto Completo: | https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-30092021-161929/ |
Resumo: | A psoríase é uma doença inflamatória crônica que apresenta aumento da expressão do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), uma citocina pró-inflamatória. Com a descoberta do RNAi, mediado pelo siRNA, foi possível eliminar a expressão de genes de interesse. No entanto, para sua aplicação, é necessário o uso de carreadores que possam proteger e liberar o siRNA nas células-alvo. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de nanopartículas híbridas polímero-lipídicas (NPLs) como sistema de liberação para o siRNA, utilizando a internalização fotoquímica como ferramenta para otimizar o escape endossomal, através do encapsulamento do fotossensibilizador TPPS2a, visando uma formulação para terapia tópica da psoríase. Para o desenvolvimento da formulação de NPLs foi aplicado o Quality by Design. As NPLs foram compostas pelo lipídio Compritol® 888 ATO (2,0%), Poloxamer 188 (1,5%) e pelo polímero catiônico polialilamina hidroclorada (PAH) (0,10%). O TPPS2a foi encapsulado na formulação, originando a formulação NPL-TPPS2a, com uma eficiência de encapsulação de 99%. As nanopartículas apresentaram um tamanho médio de 142 nm, para formulação NPL, e de 253nm, para NPL-TPPS2a, e potencial zeta positivo, para ambas. A avaliação do comportamento e ação in vitro das NPL e NPL-TPPS2a foi estudada em queratinócitos e fibroblastos, evidenciando que o tratamento, nas concentrações adequadas, não diminuiu a viabilidade celular e teve alta captação celular verificada por citometria de fluxo (acima de 80%) e por microscopia confocal. Nos estudos in vitro permeação e retenção com siRNA Alexa647 em peles de suínos, foi quantificado e mostrando a presença do siRNA e do TPPS2a nas camadas da pele nos tratamentos com a formulação NPL-TPPS2a-siRNA Alexa647. O ensaio in vivo em camundongos foi feito de acordo com o modelo de psoríase utilizando o creme IMQ. A eficácia de silenciamento da citocina TNFα in vivo foi avaliada por ELISA e histologia da pele, os resultados demonstraram que o siRNA TNFα quando veiculado pela formulação NPL-TPPS2a com irradiação (internalização fotoquímica) obteve o melhor resultado, com baixos níveis de TNFα, redução do rubor e da descamação da pele dos camundongos. Face aos resultados obtidos, pode-se concluir que as formulações desenvolvidas (NPL e NPL-TPPS2a) associadas a internalização fotoquímica do TPPS2a demonstraram ser sistemas de eficazes para administração e liberação de siRNA para a terapia tópica da psoríase. |
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Nanopartículas híbridas polímero-lipídicas associadas à internalização fotoquímica para liberação de siRNA na terapia tópica da psoríasePolymer-lipid hybrid nanoparticles combined with photochemical internalization for siRNA release in the topical therapy of psoriasisGene therapyHybrid polymer-lipid nanoparticlesInternalização fotoquímicaNanopartículas híbridas polímero-lipídicasPhotochemical internalizationPsoríasePsoriasissiRNAsiRNATerapia gênicaTerapia tópicaTopical therapyA psoríase é uma doença inflamatória crônica que apresenta aumento da expressão do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), uma citocina pró-inflamatória. Com a descoberta do RNAi, mediado pelo siRNA, foi possível eliminar a expressão de genes de interesse. No entanto, para sua aplicação, é necessário o uso de carreadores que possam proteger e liberar o siRNA nas células-alvo. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de nanopartículas híbridas polímero-lipídicas (NPLs) como sistema de liberação para o siRNA, utilizando a internalização fotoquímica como ferramenta para otimizar o escape endossomal, através do encapsulamento do fotossensibilizador TPPS2a, visando uma formulação para terapia tópica da psoríase. Para o desenvolvimento da formulação de NPLs foi aplicado o Quality by Design. As NPLs foram compostas pelo lipídio Compritol® 888 ATO (2,0%), Poloxamer 188 (1,5%) e pelo polímero catiônico polialilamina hidroclorada (PAH) (0,10%). O TPPS2a foi encapsulado na formulação, originando a formulação NPL-TPPS2a, com uma eficiência de encapsulação de 99%. As nanopartículas apresentaram um tamanho médio de 142 nm, para formulação NPL, e de 253nm, para NPL-TPPS2a, e potencial zeta positivo, para ambas. A avaliação do comportamento e ação in vitro das NPL e NPL-TPPS2a foi estudada em queratinócitos e fibroblastos, evidenciando que o tratamento, nas concentrações adequadas, não diminuiu a viabilidade celular e teve alta captação celular verificada por citometria de fluxo (acima de 80%) e por microscopia confocal. Nos estudos in vitro permeação e retenção com siRNA Alexa647 em peles de suínos, foi quantificado e mostrando a presença do siRNA e do TPPS2a nas camadas da pele nos tratamentos com a formulação NPL-TPPS2a-siRNA Alexa647. O ensaio in vivo em camundongos foi feito de acordo com o modelo de psoríase utilizando o creme IMQ. A eficácia de silenciamento da citocina TNFα in vivo foi avaliada por ELISA e histologia da pele, os resultados demonstraram que o siRNA TNFα quando veiculado pela formulação NPL-TPPS2a com irradiação (internalização fotoquímica) obteve o melhor resultado, com baixos níveis de TNFα, redução do rubor e da descamação da pele dos camundongos. Face aos resultados obtidos, pode-se concluir que as formulações desenvolvidas (NPL e NPL-TPPS2a) associadas a internalização fotoquímica do TPPS2a demonstraram ser sistemas de eficazes para administração e liberação de siRNA para a terapia tópica da psoríase.Psoriasis is a chronic inflammatory disease that presents increased expression of tumor necrosis factor alpha (TNF-α), a pro-inflammatory cytokine. With the discovery of RNAi, mediated by siRNA, it was possible to eliminate the expression of some genes of interest. However, for its application, it is necessary to use carriers that can protect and release siRNA in the target cells. In this context, the present study aimed to develop a hybrid polymer-lipid nanoparticles (PLNs) as a release system for siRNA, using photochemical internalization (PCI) as a tool to optimize the endosomal escape, through the encapsulation of the photosensitizer TPPS2a, aiming a formulation for topical therapy of psoriasis. For the development of the formulation of PLNs, Quality by Design was applied. The PLNs were composed of the lipid Compritol® 888 ATO (2.0%), Poloxamer 188 (1.5%) and the cationic hydrochlorinated polyalylamine polymer (PAH) (0.10%). TPPS2a was encapsulated in the formulation, giving rise to the formulation PLN-TPPS2a, with an encapsulation efficiency of 99%. The nanoparticles had an average size of 142 nm, for NPL formulation, and 253 nm, for PLN-TPPS2a, positive zeta potential, for both. The cell viability evaluation in vitro of PLN and PLN-TPPS2a was studied in keratinocytes and fibroblasts, showing that the treatment, in adequate concentrations, did not decrease cell viability and had high cell uptake verified by flow cytometry (above 80% ) and by confocal microscopy. In the in vitro permeation and retention studies with Alexa647 siRNA in pig skins, it was quantified and showing the presence of siRNA and TPPS2a in the skin layers in the treatments with the NPL-TPPS2a-siRNA Alexa647 formulation. The in vivo assay in mice was done according to the psoriasis model using IMQ cream. The effectiveness of silencing the cytokine TNFα in vivo was evaluated by ELISA and skin histology, the results demonstrated that the TNFα siRNA when delivered by the formulation PLN-TPPS2a with irradiation (PCI) obtained the best result, with low levels of TNFα, reduction of flushing and peeling of the mice\'s skin. In view of the results, it can be concluded that the formulations developed (PLN and PLN-TPPS2a) associated with PCI of TPPS2a proved to be effective systems for administration and release of siRNA for topical therapy of psoriasis.Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPBentley, Maria Vitoria Lopes BadraSuzuki, Isabella Luiz2020-11-16info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttps://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-30092021-161929/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPLiberar o conteúdo para acesso público.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2022-11-16T12:57:11Zoai:teses.usp.br:tde-30092021-161929Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212022-11-16T12:57:11Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false |
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A psoríase é uma doença inflamatória crônica que apresenta aumento da expressão do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), uma citocina pró-inflamatória. Com a descoberta do RNAi, mediado pelo siRNA, foi possível eliminar a expressão de genes de interesse. No entanto, para sua aplicação, é necessário o uso de carreadores que possam proteger e liberar o siRNA nas células-alvo. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de nanopartículas híbridas polímero-lipídicas (NPLs) como sistema de liberação para o siRNA, utilizando a internalização fotoquímica como ferramenta para otimizar o escape endossomal, através do encapsulamento do fotossensibilizador TPPS2a, visando uma formulação para terapia tópica da psoríase. Para o desenvolvimento da formulação de NPLs foi aplicado o Quality by Design. As NPLs foram compostas pelo lipídio Compritol® 888 ATO (2,0%), Poloxamer 188 (1,5%) e pelo polímero catiônico polialilamina hidroclorada (PAH) (0,10%). O TPPS2a foi encapsulado na formulação, originando a formulação NPL-TPPS2a, com uma eficiência de encapsulação de 99%. As nanopartículas apresentaram um tamanho médio de 142 nm, para formulação NPL, e de 253nm, para NPL-TPPS2a, e potencial zeta positivo, para ambas. A avaliação do comportamento e ação in vitro das NPL e NPL-TPPS2a foi estudada em queratinócitos e fibroblastos, evidenciando que o tratamento, nas concentrações adequadas, não diminuiu a viabilidade celular e teve alta captação celular verificada por citometria de fluxo (acima de 80%) e por microscopia confocal. Nos estudos in vitro permeação e retenção com siRNA Alexa647 em peles de suínos, foi quantificado e mostrando a presença do siRNA e do TPPS2a nas camadas da pele nos tratamentos com a formulação NPL-TPPS2a-siRNA Alexa647. O ensaio in vivo em camundongos foi feito de acordo com o modelo de psoríase utilizando o creme IMQ. A eficácia de silenciamento da citocina TNFα in vivo foi avaliada por ELISA e histologia da pele, os resultados demonstraram que o siRNA TNFα quando veiculado pela formulação NPL-TPPS2a com irradiação (internalização fotoquímica) obteve o melhor resultado, com baixos níveis de TNFα, redução do rubor e da descamação da pele dos camundongos. Face aos resultados obtidos, pode-se concluir que as formulações desenvolvidas (NPL e NPL-TPPS2a) associadas a internalização fotoquímica do TPPS2a demonstraram ser sistemas de eficazes para administração e liberação de siRNA para a terapia tópica da psoríase. |
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