Em busca de proteínas solúveis de Neospora caninum

• Autor(a) principal: Bueno, Bruno Bonamichi
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-03102016-141758/
• topic: Neospora caninum; proteínas recombinantes; expressão; proteína micronêmica tipo 2 de N. caninum (NcMIC2-like1); proteína associada à adenil ciclase de; Neospora caninum; recombinant proteins; expression; micronemic protein type 2 like 1 of N. caninum (NcMIC2-like1); cyclase-associated protein of N. ca

O protozoário Neospora caninum é considerado um dos principais causadores de abortos infecciosos na pecuária de corte e de leite no mundo. No Brasil, a presença do parasita varia de acordo com a região do país e com o tipo de rebanho, com perdas maiores na agroindústria do leite que ultrapassam US$ 50 milhões ao ano. A neosporose possui como principal manifestação clínica as perdas fetais ou abortamentos em bovinos, além de comprometimento neuronal esporádico em cães. Apesar da sua importância, a neosporose não possui atualmente tratamento eficaz e as opções de controle envolvem basicamente medidas de prevenção. As vacinas ainda são uma alternativa de desenvolvimento exploradas, sobretudo aquelas que utilizam antígenos recombinantes. Uma dificuldade ao se produzir proteínas recombinantes em sistemas de expressão heterólogos é a formação de corpúsculos de inclusão que são agregados de proteínas insolúveis. Estes agregados devem ser submetidos a processos dispendiosos para tornarem-se ativos, resultando num baixo rendimento da proteína final. Diversos recursos são utilizados para obtenção de proteínas solúveis, desde o emprego de diferentes técnicas de purificação, solubilização até o uso de tags de afinidade. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu e patenteou o vetor pET28/NcMIC2-like1/1081 que possui uma tag rica em ácido glutâmico acoplada, conhecida como Nc1081. Esta tag foi capaz de estimular a solubilidade da proteína micronêmica tipo 2 de N. caninum (NcMIC2-like1) fazendo com que a proteína recombinante (rNcMIC2-like1/1081) fosse expressa na forma solúvel. O presente trabalho procurou dar continuidade ao estudo com a rNcMIC2-like1/1080 e com a tag através da clonagem e expressão de uma outra proteína relacionada à invasão do parasita conhecida como proteína associada à adenil ciclase (NcCAP). A sequência codificadora da proteína foi clonada no vetor contendo a tag Nc1081, a proteína recombinante (rNcCAP/1081) foi expressa com um peso de 38 kDa na forma solúvel em tampão não desnaturante Tris-Cl. No teste de ELISA, as proteínas rNcMIC2-like1 e a rNcCAP acopladas ou não a tag foram detectadas com intensidade semelhante pelos respectivos soros policlonais anti-rNcMIC2-like1 e anti-rNcCAP, demonstrando que a presença da tag não influenciou no reconhecimento das proteínas. As proteínas recombinantes solúveis rNcMIC2-like1/1081 e rNcCAP/1081 ainda foram testadas através de ensaios in vitro de invasão e adesão. No ensaio de invasão, a forma solúvel de NcMIC2-like1 (rNcMIC2-like1/1081) na concentração de 5 ?g/mL, aumentou a invasão das células VERO pelo parasita, enquanto sua forma insolúvel (rNcMIC2-like1) diminuiu a invasão. Já no teste de adesão (binding), foi possível identificar que a rNcMIC2-like1/1081 aderiu à proteína serina treonina fosfatase 2C, ao fator de alongamento alfa 1 e a proteína hipotética identificada ii como NCLIV_029860, enquanto a rNcCAP/1081 aderiu à proteína hipotética NCLIV_041330. O presente trabalho permitiu o início de estudos das propriedades funcionais das proteínas NcMIC2-like1 e NcCAP que seriam inviáveis com suas formas recombinantes insolúveis, demonstrando a aplicabilidade do vetor com a tag 1081.