Desenvolvimento e validação de kit multiplex para identificação genética e teste de parentesco por análise de microssatélites em equinos

• Autor(a) principal: Ibiapina, Bruna Trentinaro
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10131/tde-17112021-131336/
• topic: Marcadores genéticos STR; Microsatellite; Microssatélite; Parentage testing; STR Genetic markers; Verificação de parentesco

O desenvolvimento da indústria equina tem aumentado a demanda por testes de verificação de parentesco para fins de registro na raça, os quais são realizados pela análise de regiões microssatélites de repetições curtas (STR). O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento exige, atualmente, a análise de 12 marcadores para o painel principal (sendo 9 obrigatórios e 3 a escolher entre outros 8) e 12 marcadores para um painel adicional (a escolher entre possíveis 15). No Brasil há apenas um kit comercial disponível para um painel principal, o qual possui elevado custo, e nenhum kit comercial disponível para o painel adicional. Desta forma, muitos laboratórios são levados a desenvolver seus próprios testes, os quais são realizados utilizando-se várias reações de PCR. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um sistema de reações múltiplas (multiplex) para cada um dos painéis com custo baixo e alta eficiência. Foi realizada análise in silico dos primers recomendados pela International Society for Animal Genetics (ISAG), organização responsável pela padronização desses testes, para 17 marcadores do painel principal (AHT4, AHT5, ASB2, ASB17, ASB23, CA425, HMS1, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, HTG10, LEX3 e VHL20) e para 15 marcadores do painel adicional (TKY279, TKY287, TKY294, TKY297, TKY301, TKY312, TKY321, TKY325, TKY333, TKY337, TKY341, TKY343, TKY344, TKY374 e TKY394), os quais foram testados, quanto a sua eficiência, em formato monoplex e depois em formato multiplex. Foram redesenhados primers para 11 marcadores STR visando a melhor eficiência do sistema multiplex para cada painel. As concentrações de cada primer foram ajustadas para obtenção de uma amplificação equilibrada para todos os loci. As amostras foram sequenciadas no equipamento ABI 3130XL® (Applied Biosystems) e posteriormente analisadas no software Genemapper® v 5.0 (Applied Biosystems). Foi desenvolvido parcialmente um sistema multiplex com 14 marcadores para o painel principal de genotipagem de equinos (AHT4, AHT5, ASB2, ASB17, HMS1, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, LEX3 e VHL20), uma vez que o marcador obrigatório HTG10 obteve resultado satisfatório apenas no formato monoplex, precisando ser testado em uma reação de PCR a parte. Os resultados das 50 amostras analisadas pelo sistema desenvolvido neste estudo, para o painel principal, foram consistentes quando comparados aos do kit comercial Equine Genotypes® (Thermo Fisher Scientific). Para o painel adicional (série TKY) foi possível o desenvolvimento composto de dois sistemas multiplex, um contemplando 8 marcadores (TKY 279, TKY297, TKY301, TKY312, TKY325, TKY337, TKY374 and TKY394) e outro contemplando 5 marcadores (TKY287, TKY321, TKY333, TKY343 and TKY344). Ambos os sistemas reproduziram os resultados das amostras referências provenientes da ISAG e testadas neste estudo. Pode ser concluído que ambos os painéis apresentaram bons resultados para análises, sendo possível desenvolver dois sistemas multiplex, atendendo o objetivo de desenvolver um método de baixo custo a alta eficiência, embora em duas etapas. Mais estudos deverão ser desenvolvidos com a finalidade de reunir em um único sistema multiplex todos os marcadores necessários.