Organogênese in vitro em laranja azeda (Citrus aurantium L.) e transformação genética de limão \'Cravo\' (Citrus limonia L. Osbeck) e laranja \'Valência\' (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene da replicase do Marafivirus

• Autor(a) principal: Silva, Rosely Pereira da
• Data de Publicação: 2008
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11136/tde-05082008-161738/
• topic: Adventitious buds; Agrobacterium tumefaciens; Citrus; Citrus sudden death disease.; Laranja; Limão; Micropropagação vegetal; Micropropagation; Morte súbita; Organogênese; Plantas transgênicas; RNA interference; Vírus de planta.

Embora desfrute de inegável importância econômica, os citros estão sujeitos a muitos problemas sanitários sendo alguns, limitantes para o cultivo como é o caso das doenças causadas por vírus. A morte súbita dos citros é uma doença relacionada à combinação copa/ porta-enxerto e manifesta sintomas na região da enxertia sobre porta-enxertos intolerantes. Embora sua etiologia não tenha sido determinada, há indicações que a causa da MSC esteja relacionada a uma estirpe do vírus da tristeza dos citros (CTV), a um vírus do gênero Marafivirus, ou a uma associação entre eles. Uma vez que a transformação genética têm sido considerada como uma ferramenta auxiliar a programas de melhoramento de citros, o objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de limão \'Cravo\' e laranja \'Valência\' contendo o gene da replicase do Marafivirus e estudar a regeneração e obtenção de plantas in vitro de laranja azeda, via organogênese, visando futuros trabalhos de transformação genética. Experimentos para indução da organogênese in vitro foram realizados avaliando-se citocininas (BAP, TDZ e CIN), em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação com ANA, condições de luminosidade (fotoperíodo de 16 h e escuro por 30 dias), meios de cultivo e explantes (provenientes de plantas germinadas in vitro e de plantas mantidas em estufa). Além disso, avaliou-se o enraizamento dos brotos regenerados. Para a transformação genética, explantes de limão \'Cravo\' e laranja \'Valência\' foram inoculados e co-cultivados com a estirpe EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens contendo o gene da replicase do Marafivirus (em seqüência sense e antisense interligadas por um íntron). A construção gênica foi elaborada a partir do plasmídeo pCAMBIA 2201, dirigidas pelo promotor 35S e terminador NOS, contendo ainda o gene de seleção nptII. A transformação foi confirmada por análises de PCR e \'Southern blot\'. A transcrição do gene foi avaliada por RT-PCR e \'northern blot\'. A adição de BAP, combinada ou não com ANA, e em combinações com CIN ao meio de cultivo, assegurou maior formação de gemas adventícias em segmentos de epicótilo de laranja azeda. Entretanto, TDZ não se mostrou favorável a essa resposta, que também é afetada pela ausência de luz. Os explantes provenientes do cultivo in vitro mostraram-se mais favoráveis à resposta organogênica. O enraizamento das brotações de laranja azeda regeneradas foi obtido no meio MT com metade da concentração de sais, sem ou com auxinas. Foi possível obter plantas transgênicas de limão \'Cravo\' e de laranja \'Valência\' contendo o gene da replicase do Marafivirus utilizando-se segmentos internodais como explantes. A análise de \'Southern blot\' confirmou a integração de um a quatro eventos de inserção do transgene no genoma das plantas. A transcrição do gene da replicase do Marafivirus e do gene nptII foi observada por RT-PCR.