Produção, purificação e modificação das adesinas de superfície recombinantes de Leptospira interrogans Lsa63 e Lsa45 e conjugação da Lsa63 com lipopolissacarídeo de Leptospira

• Autor(a) principal: Emidio, Rebeca Cordellini
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-25092023-091759/
• topic: Leptospira; Leptospira; Conjugação; Conjugation; Leptospirose; Leptospirosis; Proteína recombinante; Recombinant protein

A leptospirose é uma zoonose mundialmente disseminada causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira spp, cuja diversidade antigênica está associada ao lipopolissacarídeo de sua superfície. Adesinas de superfície de leptospiras patogênicas como as proteínas Lsa63 e Lsa45 são capazes de induzir resposta humoral em camundongos e ligarem-se a componentes de matriz extracelular facilitando a infecção pela bactéria. Atualmente, vacinas para leptospirose são compostas de bacterinas e se baseiam na proteção via indução de anticorpos contra lipopolissacarídeo. Elas não são capazes de gerar memória imunológica e são específicas contra sorovares presentes na formulação. No Brasil, não existe nenhuma vacina licenciada para uso humano contra a doença. Estudos demonstram aumento da imunogenicidade contra LPS de Leptospira patogênicas quando conjugado aos toxóides diftérico e tetânico, e também indicam a presença de antígenos comuns ou extremamente conservados entre esses LPS e a molécula proveniente de L. biflexa, saprófita. Dessa forma, esse trabalho tem por objetivo a produção, purificação e modificação das adesinas de superfície Lsa45 e Lsa63 identificadas em L. interrogans. A Lsa63 foi empregada na conjugação com o lipopolissacarídeo de L. biflexa. As melhores condições para síntese proteica foram em Escherichia coli utilizando sistema de expressão pET28a em frascos Tunair ™ e meio ZYM-5052 a 20°C para Lsa45 e em pET101 em frascos Erlenmeyer e meio 2YTON a 30°C para Lsa63. Ambas as proteínas foram purificadas através de cromatografia de afinidade ao metal seguido de troca catiônica, com pureza final e rendimento de 92% e 29% para Lsa45 e 94% e 14% para Lsa63. Uma etapa anterior à conjugação foi a modificação das proteínas com diidrazida do ácido adípico utilizando cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio como ativador, resultando em um aumento de 3 vezes no conteúdo de grupos amina para a proteína Lsa45 e de 1,4 a 2 vezes para Lsa63. Apesar das dificuldades encontradas na obtenção de massa de células, o lipopolissacarídeo de L. biflexa foi extraído através do método fenol-água a quente com rendimento de 0,9% após purificação. O lipopolissacarídeo de L. biflexa foi ativado com o tetrafluorborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridínio seguido pela conjugação com a proteína Lsa63 modificada, gerando um produto com massa molecular acima de 140 kDa. Em conjunto, nossos dados mostram o potencial de obtenção de conjugado para posterior uso em estudos imunológicos como possível candidato vacinal contra leptospirose.