Produção do fragmento de anticorpo scFv por Pichia pastoris geneticamente modificada

• Autor(a) principal: Diaz Arias, Cesar Andres
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9135/tde-28052015-103520/
• topic: Antibodies; Anticorpos; Carbon source; Fonte de carbono; Fonte de nitrogênio; kLa; kLa; Nitrogen source; Pichia pastoris; Pichia pastoris; scFv; scFv; Size yeast; Tamanho levedura

O fragmento de anticorpo scFv foi expresso pela levedura Pichia pastoris recombinante utilizando o promotor AOX1, em presença de metanol, como fonte de carbono e como modelo de expressão. Este anticorpo é considerado uma possível alternativa para o diagnóstico e tratamento da aterosclerose. Foi realizado um estudo inicial da produção do fragmento de anticorpo e do crescimento da levedura com dois bancos de trabalho diferentes, variando a fonte de carbono (glicose e glicerol). Os resultados obtidos demonstraram que as máximas concentrações celulares e a maior produção de anticorpo foram atingidas com o estoque de trabalho mantido com glicerol como fonte de carbono e de preservação. Posteriormente, foi realizado um estudo em shaker e biorreator a partir de um planejamento fatorial completo 23 em que se estudaram as variáveis tempo de indução (24, 28 e 32 horas), temperatura de indução (10, 20 e 30°C), e concentração de indutor (metanol 0,5, 1,0 e 1,5%) sobre a variável resposta produção do fragmento de anticorpo. A única variável que apresentou efeito estatisticamente significativo, com nível de confiança de 95%, foi a concentração de indutor para os dois sistemas de produção. As melhores produções de fragmento de anticorpo foram de 27,8 mg/L em shaker e de 41,3 mg/L em biorreactor. O terceiro estudo consistiu em avaliar a produção do fragmento de anticorpo em shaker pela levedura em distintas fontes de carbono (sacarose, glicerol, glicose e sacarose/glicose 50%). Neste estudo a analise de ANOVA não apresentou diferenças estatísticas significativas. Foi realizado um estudo para melhorar a quantificação do fragmento de anticorpo visando diminuir o número de etapas para evitar perdas no processo. Após obter um novo protocolo para a quantificação, realizou-se um novo estudo para avaliar a produção com as diferentes fontes de carbono. Com a analise dos resultados observou-se que todas as fontes de carbono apresentaram efeitos estatisticamente significativos, sendo que com a sacarose se obteve a maior produção com 93,7 mg/L do fragmento de anticorpo. Estes resultados foram comparados e analisados com observações realizadas ao microscópio da levedura, que demonstraram que a melhor produção de anticorpo foi obtida no momento que a levedura apresentava diâmetros menores que 0,895 µm. Seguidamente foi realizado um estudo para determinar fontes alternativas de carbono e nitrogênio (farelo de arroz e farelo de trigo) para produzir o fragmento de anticorpo, em substituição de subtratos como peptona de caseína e casaminoacidos, a maior produção obtida neste caso foi de 27,9 mg/L quando foi trocado o casaminoacidos pelo farelo de trigo. Finalmente foi avaliado o efeito do kLa no crescimento da levedura e a produção do fragmento de anticorpo scFv, os resultados demonstraram que a melhor condição para o crescimento da levedura foi com kLa 96,12 h-1, por outro lado a melhor condição para a produção do fragmento de anticorpo foi de 12,24 h-1 com relação a produção final de 8,12 mg/L de anticorpo/ g/L de célula.