Indução termoperiódica da nitrato redutase de membrana plasmática em abacaxizeiro (Ananas comosus)

• Autor(a) principal: Santos, Alessandra de Souza
• Data de Publicação: 2010
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41132/tde-07122010-105124/
• topic: Abacaxizeiro; Nitrate reductase; Nitrato redutase; Pineapple; Termoperíodo; Thermoperiod

A nitrato redutase (NR) atua juntamente com a nitrito redutase (NiR) catalisando a primeira etapa da redução do nitrato. A NR, no citossol, é ativada, principalmente, pela luz e reduz o nitrato a nitrito. Em seguida, este é reduzido a amônio. Trabalhos anteriores demonstraram que a isoforma citossólica da NR está presente nas folhas e raízes do abacaxizeiro; já as associadas à membrana plasmática (NRMP) ainda não se tem registro. Sabe-se, no entanto, que a NRMP apresenta modos diferentes de ativação, como já constatados para outras espécies. Dentre os fatores que afetam sua atividade pode-se citar a temperatura. Pesquisas realizadas no Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP, acerca da influência do termoperíodo sobre os metabolismos nitrogenado e fotossintético de plantas de abacaxizeiro, aventaram a hipótese de que haveria uma nitrato redutase específica de membrana plasmática presente nas células radiculares, a qual seria regulada por termoperíodo, diferindo, portanto, da isoforma citossólica presente nas folhas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo principal demonstrar a existência de uma isoforma da NR associada à membrana plasmática, a qual seria responsável pelo incremento da atividade dessa enzima registrada nas raízes de Ananas comosus, quando plantas cultivadas in vitro são submetidas ao termoperíodo (28°C dia/ 15°C noite). Para tanto, determinou-se o tempo mínimo de exposição das plantas de abacaxizeiro ao termoperíodo, necessário à indução da nitrato redutase radicular. Além disso, estudou-se a influência da idade das plantas na resposta ao tratamento com baixa temperatura noturna. Plantas cultivadas in vitro com 90 dias de idade ou com idades variadas foram transferidas para câmaras de crescimento com temperatura constante (28°C dia/noite controle experimental) ou com termoperíodo (28°C dia/ 15°C noite), fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 55 moles m-2 s -1. Elas permaneceram nessas condições por 1, 3, 5, 7, 15, 30, 40, 50 ou 60 dias. Após cada período, a atividade in vivo da NR foi analisada durante a fase de ausência de luz. Para que fosse possível identificar uma possível NRMP nas células radiculares de abacaxizeiro, um método de ensaio in vitro foi padronizado e a melhor técnica de isolamento de frações de membrana plasmática foi selecionada. Após as plantas com 60 dias de idade serem submetidas por 30 dias ao tratamento termoperiódico ou à temperatura constante, as frações de membrana plasmática das células radiculares foram isoladas e o ensaio in vitro da NR foi realizado, utilizando-se NADH, NADPH ou succinato como doadores de elétrons. Os resultados indicaram que o tempo mínimo de exposição das plantas de abacaxizeiro ao termoperíodo foi de 30 dias. O método de ensaio enzimático in vitro foi padronizado para as plantas de abacaxizeiro e a técnica de isolamento de frações de membrana plasmática que se mostrou mais adequada para essa bromélia foi a de fracionamento por sistema de duas fases com Dextran T-500 e PEG 3350. O grau de pureza das frações, avaliado pela detecção da atividade da enzima citoplasmática malato desidrogenase (MDH), foi em média de 95%, evidenciando a eficácia da pradronização do método. Os resultados obtidos para as frações de membranas plasmáticas, extraídas das raízes das plantas que estiveram sob o tratamento termoperiódico, mostraram que a baixa temperatura noturna influenciou positivamente a atividade da nitrato redutase. O aumento da atividade foi observado quando NADH, NADPH ou succinato foram utilizados como doadores de elétrons. Isso significa que, provavelmente, mais de uma isoforma da NRMP está presente nas raízes de abacaxizeiro. Além disso, há indícios de que a isoforma que está ligada externamente à membrana por uma âncora glicosídica (que utiliza succinato como doador de elétrons) está presente nas células radiculares do abacaxizeiro e respondeu positivamente ao estímulo da baixa temperatura noturna. Em contrapartida, nenhuma diferença pôde ser observada quando as atividades da NR foram medidas nas frações de citoplasma das plantas controle e daquelas que foram tratadas com termoperíodo. Não foi detectada atividade nas frações citossólicas quando succinato foi oferecido como poder redutor da NR. Concluiu-se, portanto, que o incremento na atividade da NR, verificado nas plantas que foram tratadas com termoperíodo, deveu-se à indução pela baixa temperatura noturna da NRMP. Esta pesquisa trouxe contribuições importantes acerca da existência de uma nitrato redutase associada à membrana plasmática em abacaxizeiro, nunca antes detectada em uma bromélia e muito pouco estudada nos demais vegetais. As padronizações realizadas serão essenciais para aplicação em outras pesquisas do Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP, abrindo oportunidades para se aprofundar ainda mais o tema sobre o controle da ativação da NR.