Estudos estruturais e bioquímicos de 10 enzimas com possível atividade de PET hidrolase oriundas de metagenoma antártico

• Autor(a) principal: Furtado, Adriano Alves
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-06102023-114452/
• topic: CBM; CBM (Carbohydrate-binding module); Cristalografia; Crystallography; Difração de raios X; PET; PET (Polyethylene Terephthalate); PETase; PETase; X-ray Diffraction

Até o momento, os plásticos têm sido os produtos com maior acúmulo nos últimos anos e sua fragmentação tem sido um dos maiores poluentes. O polietileno tereftalato (PET) é um dos materiais mais utilizados na fabricação de garrafas descartáveis e tem sido o foco estratégico para decomposição e mitigação da poluição. No entanto, os processos desenvolvidos até agora têm sido ineficientes. Com a descoberta de enzimas que degradam o PET, surge a oportunidade de aplicação biotecnológica para minimizar esses problemas. Neste trabalho, estudamos 11 enzimas recombinantes da Antártica (e uma variação) com potencial atividade catalítica contra o PET, identificadas por metagenômica. Os parâmetros de expressão proteica foram otimizados em diferentes cepas de Escherichia coli e as purificações foram realizadas em duas ou três etapas (Cromatografia de Afinidade, Troca Iônica e Exclusão Molecular) com algumas adaptações. A partir das purificações, isolamos 10 proteínas . Os ensaios de cristalização levaram a cristais para 8 enzimas, das quais obtivemos 4 estruturas cristalográficas resolvidas entre 2,32 Å e 1,2 Å. Análises estruturais das estruturas resolvidas por difração de raios-X e estruturas teóricas geradas pelo AlphaFold2 foram realizadas por meio de docking molecular entre as enzimas e um fragmento de PET. Essas análises revelaram mudanças sequenciais e estruturais críticas. Com a intenção de acumular um maior conhecimento sobre PETase, que poderia ser empregada na melhoria das enzimas para fins biotecnológicos, experimentos biofísicos e bioquímicos foram realizados, onde observamos comportamentos distintos tanto para a estabilidade térmica quanto para atividade.