Caracterização bioquímica e avaliação citotóxica de isoformas mutantes de L-asparaginase II de Dickeya chrysanthemi (Erwinia chrysanthemi)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, Iris Munhoz
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-25082022-100224/
Resumo: A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é a neoplasia mais frequente em crianças e adolescentes. Esse tumor tem como característica a auxotrofia para o aminoácido Lasparagina, o que permite que o tratamento da doença seja feito com a L-asparaginase (ASNase), enzima obtida a partir das bactérias Escherichia coli e Dickeya chrysanthemi (também denominada Erwinia chrysanthemi). A ASNase hidrolisa a L-asparagina, e Lglutamina em menor quantidade, impedindo que as células tumorais obtenham L-asparagina da circulação sanguínea para síntese de proteínas, levando a morte celular por apoptose. No entanto, as formulações disponíveis para terapêutica estão associadas a um alto índice de efeitos adversos, como toxicidade e a resistência ao medicamento causada pela produção de anticorpos e pela ação de proteases. Desta maneira, o desenvolvimento de proteoformas mutantes a partir das enzimas já comercializadas e o estudo da ação de proteases durante o tratamento podem contribuir para o desenvolvimento de uma enzima com menos efeitos adversos. Por isso, o nosso grupo de pesquisa criou uma biblioteca de mutantes utilizando a ASNase de D. chrysanthemi, por PCR propenso a erro, e de dez clones mutantes estudados uma proteoforma dupla mutante (DM) apresentou melhores parâmetros cinéticos do que a enzima selvagem (WT), sendo altamente ativa em condições fisiológicas testadas in vitro. Além disso, a enzima DM apresentou um menor reconhecimento por anticorpos antiasparaginase e o mesmo potencial citotóxico do que a enzima WT, podendo ocasionar menos efeitos adversos. Além disso, criamos as células de LLA REH knockout para protease catepsina B (CTSB) por CRISPR/cas9, e avaliamos a viabilidade celular após o tratamento com as ASNases WT de E. coli e D. chrysanthemi, e com a enzima DM. Os nossos resultados sugerem que a expressão de CTSB pelas células REH é muito baixa e não alteram a resposta ao tratamento com ASNases quando avaliadas in vitro.
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A ASNase hidrolisa a L-asparagina, e Lglutamina em menor quantidade, impedindo que as células tumorais obtenham L-asparagina da circulação sanguínea para síntese de proteínas, levando a morte celular por apoptose. No entanto, as formulações disponíveis para terapêutica estão associadas a um alto índice de efeitos adversos, como toxicidade e a resistência ao medicamento causada pela produção de anticorpos e pela ação de proteases. Desta maneira, o desenvolvimento de proteoformas mutantes a partir das enzimas já comercializadas e o estudo da ação de proteases durante o tratamento podem contribuir para o desenvolvimento de uma enzima com menos efeitos adversos. Por isso, o nosso grupo de pesquisa criou uma biblioteca de mutantes utilizando a ASNase de D. chrysanthemi, por PCR propenso a erro, e de dez clones mutantes estudados uma proteoforma dupla mutante (DM) apresentou melhores parâmetros cinéticos do que a enzima selvagem (WT), sendo altamente ativa em condições fisiológicas testadas in vitro. Além disso, a enzima DM apresentou um menor reconhecimento por anticorpos antiasparaginase e o mesmo potencial citotóxico do que a enzima WT, podendo ocasionar menos efeitos adversos. Além disso, criamos as células de LLA REH knockout para protease catepsina B (CTSB) por CRISPR/cas9, e avaliamos a viabilidade celular após o tratamento com as ASNases WT de E. coli e D. chrysanthemi, e com a enzima DM. Os nossos resultados sugerem que a expressão de CTSB pelas células REH é muito baixa e não alteram a resposta ao tratamento com ASNases quando avaliadas in vitro.Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most frequent neoplasm in children and adolescents. This tumor is characterized by auxotrophy for the amino acid L-asparagine, which allows the treatment of the disease to be carried out with L-asparaginase (ASNase), an enzyme obtained from the bacteria Escherichia coli and Dickeya chrysanthemi (also called Erwinia chrysanthemi). ASNase hydrolyzes L-asparagine, and L-glutamine to a lesser extent, preventing tumor cells from obtaining L-asparagine from the bloodstream for protein synthesis, leading to cell death by apoptosis. However, the formulations available for therapy are associated with a high rate of adverse effects, such as toxicity and drug resistance caused by the production of antibodies and the action of proteases. In this way, the development of mutant proteoforms from enzymes already commercialized and the study of the action of proteases during treatment can contribute to the development of an enzyme with fewer adverse effects. Therefore, our research group created a library of mutants using the D. chrysanthemi ASNase, by error prone PCR, and from ten mutant clones studied a double mutant proteoform (DM) showed better kinetic parameters than the wild-type enzyme (WT), being highly active under physiological conditions tested in vitro. In addition, the DM enzyme showed less recognition by anti-asparaginase antibodies and the same cytotoxic potential as the WT enzyme, which may cause fewer adverse effects. In addition, we created REH ALL cells knockout for cathepsin B (CTSB) protease by CRISPR/cas9, and evaluated cell viability after treatment with E. coli and D. chrysanthemi WT ASNases, and with the DM enzyme. Our results suggest that the expression of CTSB by REH cells is very low and does not alter the response to treatment with ASNases when evaluated in vitro.Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPMonteiro, GiseleCosta, Iris Munhoz2022-07-08info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttps://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-25082022-100224/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPLiberar o conteúdo para acesso público.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2022-09-15T12:17:00Zoai:teses.usp.br:tde-25082022-100224Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212022-09-15T12:17Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false
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Costa, Iris Munhoz
Acute lymphoblastic leukemia
Catepsina B
Cathepsin B
CRISPR/cas9
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Edição genica
Engenharia de proteína
Erwinia chrysanthemi
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Genetic editing
L-asparaginase
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Leucemia linfoblástica aguda
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