Avaliação de método diagnóstico não invasivo para leishmaniose tegumentar americana através da reação em cadeia da polimerase

• Autor(a) principal: Boni, Sara Macente
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5134/tde-06012017-113026/
• topic: Diagnosis; Diagnóstico; DNA de Cinetoplasto; DNA kinetoplast; HSP70 heat-shock proteins; Leishmaniasis cutaneous; Leishmaniose; Mucosa Nasal; Nasal mucosa; Polymerase chain reaction; Proteínas de choque térmico Hsp70; Reação em cadeia da polimerase

Introdução: O diagnóstico etiológico da leishmaniose tegumentar baseia-se na detecção do parasito em amostras de lesão colhida por método invasivo. A detecção de DNA do parasito, através da PCR, poderia ser uma alternativa mais sensível, porém não está disponível na rotina diagnóstica e foi padronizada em amostras clínicas colhidas por métodos invasivos, tais como raspado, aspirado ou biópsia da lesão. Uma proposta para o diagnóstico de leishmaniose tegumentar seria a obtenção de material de lesão (mucosa ou cutânea) através de métodos de coleta menos invasivos e que fosse possível detectar DNA do parasito a partir de pequenas quantidades de amostra clínica. Neste trabalho avaliamos a eficácia da PCR, em amostras colhidas por método não invasivo (swab de lesão) como ferramenta para ser utilizada no diagnóstico de leishmaniose (mucosa e cutânea localizada), bem como para detecção precoce de Leishmania em mucosa de pacientes com lesão cutânea ativa e como ferramenta de avaliação de resposta terapêutica na leishmaniose mucosa. Metodologia: Entre os meses de agosto de 2013 a julho de 2015 foram selecionados 57 pacientes no ambulatório de Leishmanioses do Instituto de Infectologia Emilio Ribas, dos quais foram coletadas amostras de lesão cutânea ou mucosa através de swab e de biópsia das lesões. Em paralelo, foi realizada rotina laboratorial para diagnóstico de leishmaniose nos pacientes que apresentavam lesão ativa (anatomopatológico, pesquisa e cultura de Leishmania, sorologia e teste de Montenegro). As amostras colhidas por biópsia ou swab foram avaliadas através da reação em cadeia da polimerase tendo como alvos o minicírculo do DNA do cinetoplasto (kDNA) de Leishmania para PCR convencional e o gene da proteína de choque térmico 70Kda (Hsp70) para PCR convencional e PCR em tempo real. Resultados: A detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab de lesões ativas foi semelhante as das amostras colhidas por biópsia das mesmas lesões. Quando comparado aos métodos comumente empregados no diagnóstico da leishmaniose tegumentar, a PCR em material colhido por swab apresentou desempenho superior. Foi demostrado que utilizando os iniciadores para o alvo kDNA obtivemos maior eficácia quando comparado com o alvo Hsp70, seja pela PCR convencional como pela PCR em tempo real (sensibilidade de 94.1%, 42.4% e 39.4%, respectivamente). Ao analisarmos amostras de pacientes já tratados para leishmaniose mucosa observamos positividade de 86% para kDNA e de 22% para Hsp70. Nas amostras de mucosa nasal íntegra e com leishmaniose cutânea ativa, coletadas com swab para detecção precoce da doença, obteve-se 92.9% de positividade com kDNA e 28.6% com Hsp70. Conclusões: Os resultados obtidos sugerem que o método de coleta de amostra biológica através do swab para o diagnóstico molecular da leishmaniose tegumentar apresenta eficácia comparada com o método de coleta por biópsia. A detecção de DNA em amostras colhidas por swab permite analisar a presença de DNA do parasito em tecido sem lesão, podendo detectar a presença de Leishmania mesmo antes de alterações clínicas estarem presentes. A monitorização da resposta terapêutica da leishmaniose mucosa pode ser feita através da detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab