Estudos estruturais e termodinâmicos de centrinas BeCen1 e BeCen3 do fungo Blastocladiella emersonii

• Autor(a) principal: Camargo, Ana Isabel de
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-30082011-082206/
• topic: Blastocladiella emersonii; Blastocladiella emersonii; Calcium binding proteins; Centrinas; Centrins; Domínio EF-Hand; EF-Hand domain; Formação de filamentos; Protein filaments; Proteínas ligantes de cálcio

Centrinas são proteínas componentes essenciais nos centro organizadores de microtubulos em diversos organismos. Pertencem à família das proteínas EF-Hand ligantes de cálcio e podem ser divididas em duas subfamílias: uma definida pela centrina da alga Chlamydomonas reinhardtii CrCenp, associada a funções contráteis, e a outra pela centrina da levedura Saccharomices cerevisiae ScCdc31p, relacionada a duplicação de centros mitóticos. Curiosamente o fungo Blastocladiella emersonii possui duas formas de centrinas em seu genoma : BeCen1 mais parecida com a CrCenp, e BeCen3 com a ScCdc31p, enquanto todos os outros fungos já descritos possuem apenas uma forma, pertencente ao grupo ScCdc31p. Diante desse fato curioso, descrito em 2005, estudos estruturais e termodinâmicos comparativos entre as proteínas recombinantes BeCen1 e BeCen3, foram desenvolvidos para identificar e caracterizar diferenças relevantes, que pudessem justificar a presença dessas duas proteínas no fungo Blatocladiella emersonii. Ambas as centrinas foram expressas em E. coli e purificadas por cromatografia, resultando em um rendimento de aproximadamente 5mg/l. Analises estruturais foram realizadas utilizando técnicas de dicroísmo circular (CD) , fluorescência, espalhamento de luz (DLS e RALS), microscopias de força atômica (AFM) e eletrônica de transmissão (MET). Por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) parâmetros termodinâmicos foram obtidos para BeCen1 e BeCen3 em relação a ligação de cálcio. Ambas apresentaram conteúdo predominante de hélices alfa e diferenças físico-químicas e estruturais marcantes. BeCen1, após desnaturação a 90ºC e deixada a temperatura de 4°C por 24 horas horas, mostrou um espectro de CD compatível com um processo de reenovelamento; a TM foi de 42°C e aumentou cerca de 4°C na forma holo; os espectros de CD são modificados na presença de cálcio, mostrando uma forma característica de movimentação de hélices das proteínas ligantes de cálcio; pelos dados obtidos por ITC liga cálcio em três sítios EF-Hand por uma reação endotérmica; na presença de magnésio apresentou mudanças conformacionais, compatíveis com a ligação deste nos sítios de cálcio; a partir de 40°C é observado um processo de agregação chegando a formação de filamentos, que foram visualizados por AFM e MET. BeCen3 após ser desnaturada e colocada nas mesmas condições de BeCen1, permanece desnaturada; A TM é de 49°C e aumentou em aproximadamente 5°C na forma holo; os espectros de CD, na presença de cálcio, apresentam aspectos característicos de movimentação de -hélices das proteínas ligantes de cálcio; liga cálcio em apenas dois sítios EF-Hand por uma reação exotérmica, sofre mudanças conformacionais na presença de magnésio e a partir de 30°C já sofre um processo de agregação, formando filamentos. Neste trabalho foi estabelecido o primeiro protocolo para a expressão e purificação das centrinas de B. emersonii, além dos estudos de caracterização estrutural e termodinâmica destas proteínas. O estudo também foi pioneiro quanto a obtenção de imagens no processo de formação de filamentos destas centrinas na ausência de cálcio. As centrinas de B. emersonii apresentam diferenças importantes nas respostas em função da presença de cálcio e também do magnésio. Os dados obtidos são fortes indicativos que estas centrinas têm mecanismos de ação diferentes dentro do fungo B. emersonii.