Análise ultraestrutural e implicação do RNA de interferência na fibrilogênese do colágeno V em pacientes com esclerodermia

• Autor(a) principal: Morais, Jymenez de
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5164/tde-09022015-122559/
• topic: Colágeno tipo V; Colágeno/biossíntese; Colágeno/ultraestrutura; Collagen/biosynthesis; Collagen/ultrastructure; Esclerodermia; Fibrose; Fibrosis; Pele/ultraestrutura; Scleroderma; Skin/ultrastructure; Type V collagen

Introdução: Recentemente muitas são as funções atribuídas ao colágeno V em condições fisiológicas normais e em algumas doenças, como na esclerodermia. Esta proteína apresenta características estruturais singulares de regulação do diâmetro das fibrilas heterotípicas, e imunogenicidade, sendo capaz de desencadear uma resposta imune independente. Em descobertas recentes, desenvolvidas por nosso grupo, ficou evidenciado que o colágeno V apresenta histoarquitetura anômala, aumentando a sua imunoexpressão na pele e pulmão em estágios iniciais da doença, assim como, aumento do RNAm de suas cadeias, principalmente alfa2(V). Por esta razão e com o intuito de entender sobre os processos moleculares e ultraestruturais que correlacionam o COL V à fibrose na ES, a proposta do presente estudo foi realizar análise morfológica e ultraestrutural das cadeias, alfa1(V) e alfa2(V), da pele de pacientes com ES, assim como avaliar a influência do gene COL5A2 na fibrilogênese. Pacientes e Métodos: As análises foram desenvolvidas utilizando fragmento de pele obtidas de biópsia, tanto de pacientes como controles, sob aprovação do comitê de ética (CAPPesq 0331/10) e de acordo com Declaração de Helsinque. Participaram do estudo 7 pacientes (homens=3, mulheres=4) diagnosticados com ES há dois anos ou menos, e indivíduos voluntários saudáveis (n=7) utilizados como grupo controle. A biópsia das peles foi dividida para dois grupos de análises: estudos histológicos e cultura de fibroblastos; sob solução de formol a 10%, foram realizadas análises histomorfométricas [coloração de Hematoxilina e Eosina (H e E), Tricrômico de Masson, imunofluorescência (IM) para cadeias alfa1(V) e alfa2(V), e reconstrução tridimensional (Zeiss LSM 510 META/UV)], e em solução de glutaraldeído 2% para análise ultraestrutural (microscopia eletrônica de transmissão com imunomarcação com ouro coloidal). A quantificação das cadeias foi realizada por histomorfometria, através de análise de imagem utilizando o software Image Pro-Plus 6.0. Já a cultura de fibroblastos foi desenvolvida para avaliar: distribuição e perfil das cadeias alfa1(V) e alfa2(V) [reconstrução 3D (Zeiss LSM 510 META/UV)],expressão gênica COL5A1, COL5A2 e ITGA2 [qRT-PCR (Applied Biosystems)], e inibição temporária do gene COL5A2. Resultados: Na análise morfológica (H&E e Masson) observou-se modificação da histoarquitetura da pele dos pacientes, com espessamento e retificação da epiderme devido ao aumento na densidade das fibras colágenas, com projeções das papilas dérmicas em direção à derme papilar. Esse resultado foi confirmado na quantificação das cadeias (IM), evidenciado por perda acentuada da cadeia alfa1(V) na derme papilar [12,77 ± 1,344 vs 66,84± 3,36 (p < 0,0001)] e aumento significante da expressão da cadeias alfa1(V) e alfa2(V) na derme reticular alfa1(V) [7,657 ± 0,2133 vs 13,75 ± 0,958 ( p < 0,0001)] e alfa2(V) [5,072 ± 0,4117 vs 21,07 ± 0,790 (p=0,001)] dos pacientes quando comparados ao controle. Assim como visto na imunomarcação com ouro coloidal das cadeias do COLV, houve ausência de expressão linear da cadeia alfa1(V) na derme papilar, contrastando com a expressão da mesma na pele de controles, se contrapondo a forte imunoexpressão das cadeias alfa1(V) e alfa2(V) com uma maior evidência da cadeia alfa2(V) na região espessada pela junção lâmina basal e derme reticular. A reconstrução 3D em cultura de fibroblastos dérmicos demonstrou grande atividade das células de pacientes com ES, confirmado na expressão gênica dos COL5A1, COL5A2 e ITGA2, que se mostraram aumentados significantemente nos pacientes em relação ao controle. Por fim, após inibição do COL5A2 houve uma tendência ao aumento na expressão do COL5A1, e superexpressão da ITGA2. Conclusão: A alteração dérmica observada em pacientes com ES esta correlacionada com a modificação na distribuição das cadeias alfas do COLV, principalmente por perda acentuada da alfa1(V)3 homotrímera na derme papilar e superexpressão da alfa2(V) em capilares e vasos, interferindo na formação de matriz extracelular normal, sugerindo uma alteração pós traducional desta proteína, e que maiores estudos sobre a inibição da cadeia alfa2(V) são importantes para uma futura terapia gênica para atenuar os sintomas desencadeados nesta patologia