Caracterização molecular, virulência e suscentibilidade ao fluconazol de espécies ambientais de \'Cryptococcus\', antes e após inoculação em modelo murino

• Autor(a) principal: Pedroso, Reginaldo dos Santos
• Data de Publicação: 2008
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-18082008-133009/
• topic: Cryptococcus spp; Cryptococcus spp; Fatores de virulência; Molecular typing; Patogenicidade; Patogenicity; Tipagem molecular; Virulence factors

Cryptococcus neoformans e C. gattii são as principais espécies do gênero que causam infecção no homem, C. albidus e C. laurentii são espécies menos envolvidas. O presente trabalho teve por objetivos avaliar a patogenicidade in vivo, os fatores e os genes relacionados à virulência, e verificar o perfil de suscetibilidade ao fluconazol de 10 isolados ambientais de cada uma das espécies: C. neoformans, C. albidus e C. laurentii, antes e após a inoculação em camundongos BALB/c imunocompetentes; pesquisar os sorotipos, mating types e realizar a tipagem molecular. Proteinase, fosfolipase, urease, produção de melanina e crescimento à 37ºC foram pesquisados utilizando metodologias clássicas, e a pesquisa dos genes e determinação dos sorotipos e mating types foram feitas por PCR. A tipagem molecular foi realizada por PCR-fingerprinting, com os iniciadores (GACA)4 e M13. A determinação da CIM do fluconazol foi realizada pelo método da microdiluição em caldo. Todos os isolados de C. neoformans foram sorotipos A e MAT-alfa. A inoculação em animais mostrou que 9 isolados de C. neoformans mataram 100% deles em até 33 dias, e 1 levou os animais à morte num período entre 40 e 82 dias; 9 isolados foram recuperados dos pulmões e cérebro dos animais em 7 e 14 dias, e um deles levou todos os animais à morte em 12 dias, sendo possível recuperá-lo somente no 7º dia. Os animais inoculados com C. albidus e C. laurentii permaneceram vivos até negativação das culturas dos órgãos avaliados. C. albidus foi isolado principalmente do fígado e dos pulmões até 10 dias após a inoculação, C. laurentii dos pulmões e do cérebro até 120 dias. Todos os isolados das 3 espécies produziram cápsula antes e após a inoculação. Todos C. neoformans, 6 C. albidus e 6 C. laurentii cresceram à 37ºC antes e depois da inoculação. Melanina foi produzida por todos os isolados de C. neoformans e nenhum C. albidus nas duas ocasiões; e por 6 e 9 isolados de C. laurentii, antes e depois da inoculação, respectivamente. Seis isolados de C. neoformans e 1 de C. laurentii produziram proteinase nas duas ocasiões. Sete isolados de C. albidus produziram proteinase antes e todos depois da inoculação. Fosfolipase foi produzida por todos C. neoformans e C. albidus, e por 6 C. laurentii nas duas ocasiões. A avaliação da atividade da urease realizada em meio líquido foi positiva em 24 a 48 horas pelos isolados de C. neoformans e C. laurentii, e em 24 a 96 horas por C. albidus. A CIM de fluconazol variou de 2 a 8 ug/mL para C. neoformans, de 8 a >= 64 ug/mL para C. albidus, e de 1 a 64 ug/mL para C. laurentii, nas duas ocasiões. Todos os isolados de C. neoformans apresentaram os genes lacase (Lac1), fosfolipase (PLB1), proteinase (cnap1), calcineurina (CNA1), urease (URE1), e ERG11, com os oligonucleotídeos utilizados. A PCR com ERG11 mostrou uma banda no gel de agarose para todos C. albidus, porém nenhum dos outros genes pesquisados foram amplificados em C. albidus e C. laurentii. A tipagem molecular por PCR-fingerprinting dos isolados de C. neoformans revelou 2 tipos moleculares: VNI (7 isolados) e VNII (3 isolados). A maioria dos isolados de C. albidus apresentou homogeneidade nos padrões de bandas gerados, e C. laurentii foi a espécie que demonstrou maior diversidade genética por esta metodologia. Concluímos que a passagem dos isolados pelos animais não alterou os fenótipos estudados e nenhuma alteração foi detectada pela análise molecular. No entanto, verificamos a grande heterogeneidade molecular dos isolados de C. laurentii estudados.