Estudos bioquímicos e estruturais de uma metaloprotease isolada da peçonha de Bothrops pirajai

• Autor(a) principal: Bernardes, Carolina Petri
• Data de Publicação: 2012
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-11012013-110805/
• topic: Basement membrane; Bothrops piraja; Bothrops pirajai; Enzimas proteolíticas; Hemorragia; Hemorrhage; Hemostasia. Inf; Hemostasis; Membrana basal; Metalloproteinase; Metaloprotease; Proteolytic enzymes

As peçonhas de serpentes são misturas complexas de moléculas bioativas resultando em um produto biológico eficiente que tem como principais objetivos a promoção de imobilização, morte e digestão inicial de presas. As metaloproteases e as serinoproteases estão entre as principais enzimas responsáveis por afetar o sistema hemostático por diferentes mecanismos. O presente trabalho teve como objetivo o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de uma metaloprotease da classe P-I a partir da peçonha de Bothrops pirajai. A metaloprotease foi isolada utilizando três passos cromatográficos: exclusão molecular em Sephacryl S-200, troca iônica em CMSepharose e afinidade em Blue Sepharose, resultando na metaloprotease denominada BpirMP. A massa molecular da enzima foi determinada por espectrometria de massas (23,15 kDa), e conforme visualizado por SDS-PAGE, a molécula apresentou cadeia polipeptídica única. A determinação da sequência parcial de aminoácidos e o alinhamento múltiplo com sequências depositadas em bancos de dados mostrou alta identidade (70-90%) com outras metaloproteases da classe P-I de peçonhas de serpentes. A molécula possui a sequência de consenso HELGHNLGMEH, bem como a sequência de CVM, que caracterizam a superfamília das metaloproteases \"metzincinas\". A enzima mostrou ação sobre o fibrinogênio, degradando as cadeias Aα e Bβ, sendo capaz também de degradar coágulos de fibrina e de sangue in vitro, dissolvendo completamente o coágulo de sangue na maior dose testada. A enzima não apresentou atividade coagulante sobre plasma sanguíneo. A atividade proteolítica da metaloprotease sobre a azocaseína foi avaliada em diferentes condições de pH e temperatura, mostrando que a enzima tem a sua atividade reduzida em pHs ácidos e em temperaturas superiores a 60 ºC. A atividade proteolítica foi inibida por agentes quelantes como EDTA, EGTA e 1,10- fenantrolina e por agentes redutores como β-mercaptoetanol e DTT. Inibidores específicos de serinoproteases (benzamidina, leupeptina e aprotinina) não apresentaram efeito sobre a atividade proteolítica da BpirMP. A enzima mostrou-se hemorrágica, apresentando dose hemorrágica mínima (DHM) de 50 µg. BpirMP hidrolisou componentes da membrana basal tanto in vitro como in vivo, degradando preferencialmente laminina e nidogênio. A metaloprotease apresentou efeitos sobre processos inflamatórios como a indução de edema e dor, promovendo um pronunciado recrutamento de neutrófilos e aumento significativo na quantidade total de leucócitos no exsudato inflamatório. A avaliação da participação de diferentes mediadores inflamatórios na indução do edema e hiperalgesia indicaram o envolvimento de metabólitos do ácido araquidônico e histamina. O efeito citotóxico induzido pela metaloprotease foi avaliado sobre o músculo gastrocnêmico de camundongos e também nos tecidos cardíaco, renal, pulmonar e esplênico, apresentando degeneração das fibras musculares e infiltrado leucocitário. Os resultados demonstram que a BpirMP é uma metaloprotease de baixa massa molecular, com baixa atividade hemorrágica, pertencente à classe P-I, descrita pela primeira vez para a espécie B. pirajai. A caracterização da peçonha de Bothrops pirajai foi realizada por meio de técnicas proteômicas para determinar a sua composição proteica. As proteínas foram separadas por RP-HPLC, seguido por SDS-PAGE, digestão tríptica \"in-gel\" e identificação por espectrometria de massa por MALDI-TOF/TOF, e atribuição de famílias de proteínas conhecidas por homologia. Proteínas pertencentes a sete famílias foram encontradas na peçonha de B. pirajai, incluindo grande abundância de fosfolipases A2 (~40%) e metaloproteases (~20%).