Transcriptoma e expressão recombinante de peptidases do fungo Phanerochaete chrysosporium em Pichia pastoris

• Autor(a) principal: Simões, Flávio Antônio de Oliveira
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-18122019-171832/
• topic: Aspartic peptidase; Aspartil peptidase; Cisteíno peptidase; Cysteine peptidase; Peptidases recombinantes; Recombinant peptidases

Os fungos possuem uma grande diversidade genética e habitam os mais variados hábitats. Esses microrganismos podem ser fontes de enzimas que atuam em condições de temperatura e pH que as tornam interessantes para bioprocessos industriais. O Phanerochaete chrysosporium possui em seu genoma genes do citocromo p450, além de uma grande variedade de oxidases e hidrolases, que incluem as peptidases. As peptidases estão envolvidas em diversas vias biológicas e possuem diversas aplicações industriais (indústria alimentícia, farmacêutica e têxtil). Duas peptidases (aspartil e cisteíno peptidases) produzidas pelo P. chrysosporium já foram identificadas em sua forma nativa por nosso grupo de pesquisa e a expressão recombinante dessas proteínas pode fornecer meios para a caracterização bioquímica e funcional. O sistema Pichia patoris possui um eficiente sistema de secreção de proteínas e é capaz de realizar modificações pós-traducionais, produzindo enzimas recombinantes funcionalmente ativas. O objetivo deste estudo foi realizar o transcriptoma do fungo Phanerochaete chrysosporium para identificação e expressão recombinante de peptidases aspartil e cisteíno para estudos bioquímicos e funcionais. Para isso, o P. chrysosporium foi submetido à diferentes cultivos suplementados com farinha de pena (1%), ou caseína (1%), ou avicel (1%), ou azeite (1%). Foram feitos ensaios de atividade enzimática para peptidase, lacase, amilase, lipase, CMCase, xilanase e pectinase. Foram detectadas atividade para todas as enzimas em todas as condições, exceto pectinase e lipase. Os extratos suplementados com farinha de pena foram purificados em cromatografia de troca iônia e o N-terminal da aspartil e da cisteíno peptidases foi sequenciado via degradação de Edman. O micélio das culturas foi usado para extração do RNA e síntese do cDNA para a construção da biblioteca de transcritos, que gerou 33840 sequências. A biblioteca foi submetida a análise pelo UNIPROT e 7327 sequências foram identificadas (52% não enzimas e 48% enzimas). As classes enzimáticas com maior número de sequências foram das hidrolases, transferases e oxidorredutases, com 34%, 30% e 23%, respectivamente. Quanto as peptidases, 1208 foram anotadas como pertencentes a essa subclasse, sendo aspartil peptidases 16,2%, seguida de ômega peptidases 15,1%, de metalo peptidases 10,8%, serino peptidases 10,4% e cisteíno peptidases, 8,3%. A sequência obtida do N-terminal da aspartil peptidase foi utilizada para busca na biblioteca de transcritos. A busca revelou 5 isoformas da mesma sequência DN10508 (2, 6, 7, 10 e 11) e após a análise a isoforma 10 foi selecionada para expressão heteróloga. A busca da sequência da cisteíno peptidase foi feita através da anotação funcional da biblioteca e duas sequências foram encontradas DN7040, isoforma 1 e 3. A isoforma 3 foi selecionada para expressão heteróloga, após análise dos domínios e da massa teórica da sequência. As sequências selecionadas foram clonadas no vetor pPICZ?A. Os clones de P. pastoris contendo as construções foram submetidos a um screening (20 clones de cada construção) em mini biorreatores Corning, induzido com metanol. A atividade enzimática dos clones contendo a construção pPICZ?A-DN10508 (aspartil peptidase) mostraram que os clones 1 (16,00 ± 3,27 U/mL) ,2 (14,44 ± 1,12 U/mL), 11 (14,27± 0,315 U/mL), 4 (14,27 ± 0,086 U/mL) e 5 (14,15 ± 2,15 U/mL) obtiveram a maior atividade enzimática. A atividade enzimática dos clones contendo pPICZ?A-DN7040 (cisteíno peptidase) não apresentaram resultados promissores. Nas condições avaliadas foi possível induzir a expressão de diferentes classes enzimáticas. A biblioteca de transcritos gerou mais de 33 mil sequências e através dela, foi possível selecionar e expressar duas peptidases (aspartil e cisteíno peptidases) para a expressão heteróloga