Caracterização do processo de diferenciação sincicial no labirinto de placentas de camundongo.

• Autor(a) principal: Daolio, Gabriela Aparecida Jorge
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42134/tde-08102018-161643/
• topic: Barreira placentária; Caspase-8; Caspase-8; Labirinto; Labyrinth; Placenta; Placenta; Placental barrier; Sinciciotrofoblasto; Syncytiotrophoblast

A barreira placentária é constituída por duas camadas de células sinciciais, uma camada de células trofoblásticas gigantes e o endotélio fetal. Apesar da importância das camadas sinciciais no transporte molecular entre mãe e feto, o exato mecanismo de formação dessa barreira não está completamente elucidado em camundongos. Em humanos, estudos sugerem que a formação do sinciciotrofoblasto ocorre por um processo de fusão celular dependente de Caspase- 8, uma proteína iniciadora da cascata de apoptose. Desta forma, este estudo teve como proposta analisar o processo de formação das camadas sinciciais do labirinto em placentas de camundongos e o possível envolvimento da caspase-8 neste processo. Sítios de implantação foram coletados de camundongos fêmeas nos dias 8,5 a 11,5 de gestação e caracterizados morfologicamente através de marcadores de células precursoras sinciciais (EpCAM) e de células sinciciais maduras (Slc16A3) por meio de reações imunohitoquímicas. A expressão gênica dos marcadores diferenciais de células sinciciais também foi analisada por RT-PCR na região labiríntica dissecada nos diferentes dias de gestação. A expressão de Caspase-8 total e clivada também foi avaliada por Western blot e a relação entre a presença de Caspase-8 clivada e a indução de apoptose, avaliada por TUNEL e pela imunolocalização da Citoqueratina 18 clivada. Tambem foram realizadas análises com células labirínticas cultivadas, isoladas nos dias 8,5 a 10,5 de gestação. As células cultivadas foram caracterizadas morfologicamente e avaliadas quanto a expressão gênica de marcadores sinciciais e proteica de Caspase-8. Nossos resultados mostraram que os primeiros sinais morfológicos de formação da barreira placentária ocorream no dia 9,5 de gestação. O marcador EpCAM foi encontrado na base da placenta nos dias 8,5 e 9,5. No dia 11,5 de gestação, o labirinto já se encontra estruturado e funcional, o que foi indicado pela expressão de Slc16A3, nos dias 10,5 e 11,5 de gestação. A expressão gênica dos fatores de transcrição associados ao desenvolvimento das camadas sinciciais mostraram expressões crescentes ao longo do período estudado. Caspase-8 total e clivada mostrou intensa expressão no dia 9,5 de gestação, e aparentemente não estava associada à morte celular por apoptose, uma vez que não se detectou reatividade pela reação de TUNEL ou imunomarcação de Citoqueratina 18 clivada nas células labirínticas em formação em nenhum dos dias estudados. Células labirínticas obtidas aos 9,5 dias de gestação e cultivadas formaram ninhos celulares ao longo das 48 horas de cultura, com indícios morfológicos de sincicialização. A imunolocalização do marcador de células progenitoras do labirinto, EpCAM foi mais intensa nas culturas de 6 horas e se limitou a áreas ao redor dos ninhos celulares após 48 horas. Inversamente, a imunolocalização do transportador sincicial Slc16A3 não foi observada após 6 horas de cultura, mas foi bastante intensa no centro dos ninhos celulares após 48 horas. As culturas de labirinto de 9,5 das de gestação, também mostraram aumento de expressão das Sincitinas A e B ao longo do tempo de cultivo. A análise da expressão proteica de Caspase-8 mostrou expressão mais alta após 6 horas de cultivo do que a observada nos demais tempos experimentais. Por outro lado, a forma ativa (clivada) da caspase aumentou gradativamente após 24 e 48 horas de cultivo. Culturas submetidas ao tratamento com o inibidor farmacológico de Caspase-8 z-IEDT-fmk, mostraram perfis morfológicos alterados com redução da formação dos ninhos celulares e diminuição da reatividade ao Slc16A3. A expressão dos marcadores de diferenciação Sincitina A e B também foi significativamente diminuída (p<0.05) nestes experimentos em que a inibição da Caspase-8 clivada foi comprovada por Western blot. Estes achados mostraram a expressão de Caspase- 8, principalmente no dia 9,5 de gestação, nas células trofoblásticas labirínticas da placenta de camundongos e sugerem sua participação na formação das camadas sinciciais do labirinto.