Clonagem e expressão da Homoserina Desidrogenase de Paracoccidioides brasiliensis em células de Escherichia coli e sua caracterização estrutural

• Autor(a) principal: Santos, Jessyka Lima
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-12112019-180249/
• topic: homoserina desidrogenase; homoserine dehydrogenase.; paracoccidioides brasilienses; paracoccidioides brasilienses; paracoccidioidomicose; paracoccidioidomycosis

A paracoccidioidomicose é uma micose granulomatosa sistêmica causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis. Esta doença é a mais importante infecção fúngica na América Latina e um importante problema de saúde no Brasil, representando 51% das mortes por infecção fúngica. A homoserina desidrogenase é uma enzima oxidorredutase que atua na síntese de aminoácidos no metabolismo de fungos e plantas, não sendo encontrada em humanos. Tal fato tornou-a um alvo em potencial para o desenvolvimento de novos fármacos específicos para o tratamento da doença. O objetivo deste trabalho foi a superexpressão heteróloga em Escherichia coli, purificação e caracterização estrutural e funcional da homoserina desidrogenase da Paracoccidioides brasiliensis, a fim de fornecer base científica para posteriores estudos farmacológicos. A proteína homoserina desidrogenase foi expressa em vetor pET-SUMO na forma solúvel, obtendo-se uma quantidade média de 29,672 ± 6,828 mg de proteína por litro de expressão com aproximadamente 94% de pureza. A análise por espectroscopia de dicroísmo circular apresentou um perfil espectral de uma estrutura secundária predominantemente formada por hélices α, 45,5 ± 7,3 %, e com pouca contribuição de fitas β, 10,5 ± 7,0 %. As análises por espectroscopia de emissão de fluorescência mostraram que a proteína possui uma boa estabilidade na presença do agente desnaturante ureia, apresentando um Cm de 4,13 ± 0,21 M de ureia, e uma ampla faixa de pH na qual não há mudança conformacional, do pH 6 ao pH 10. Na análise por calorimetria diferencial de varredura foi possível verificar que a proteína possui uma alta estabilidade a temperatura ambiente, porém uma baixa estabilidade em altas temperaturas, sofrendo uma desnaturação irreversível, a Tm obtida foi de 58,65 ± 0,87 °C. Os estudos da atividade enzimática da homoserina desidrogenase por espectroscopia de absorção molecular no UV/Vis mostrou que a proteína possui um pH ótimo entre 9,35 e 9,50, um comportamento michaeliano, que a reação enzimática se dá por meio de um processo não cooperativo, que a enzima possui um KM de 0,266 mM e um VMax de 1,78 mM s-1 e que a mesma não é sensível a inibição por treonina com um IC50 de 184 ± 3,0 mM. Portanto, a expressão e purificação da proteína foram eficientes e as análises de caracterização estrutural mostraram que a proteína foi obtida na forma enovelada e enzimaticamente ativa, sendo bastante estável frente a diversos agentes externos.