Papel de proteínas VgrG parálogas no sistema de secreção do tipo VI de Chromobacterium violaceum

• Autor(a) principal: Fernanda Carvalho Leal
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://doi.org/10.11606/D.17.2020.tde-04012021-111327

O sistema de secreção do tipo VI (T6SS) injeta efetores tóxicos dentro das células alvo expelindo um aparato de punção composto por proteínas Hcp, VgrG e PAAR. Ainda não se sabe exatamente como as proteínas efetoras se ligam à VgrG ou o motivo da existência de várias cópias de VgrG em algumas bactérias. Recentemente, nosso grupo mostrou que a bactéria Gram-negativa Chromobacterium violaceum possui um T6SS funcional com atividade antibacteriana. O objetivo do presente trabalho é investigar os genes vgrGs do T6SS de C. violaceum. As análises in silico revelaram que C. violaceum possui seis genes vgrGs (vgrG1 a vgrG6), com os genes vgrG1 e vgrG2 localizados no cluster principal do T6SS e os demais quatro genes vgrGs localizados em clusters órfãos. As seis proteínas VgrGs apresentaram alta identidade de sequência (de 70% a 93%) e a mesma organização de domínios, com todas possuindo um potencial domínio adaptador no C-terminal. Linhagens mutantes foram obtidas com deleção individual de cada gene vgrG ou deleção sequencial até obter uma linhagem mutante sêxtupla (ΔvgrG1-6). Cada gene vgrG foi introduzido no mutante sêxtuplo. Os ensaios de competição contra bactérias como Pseudomonas aeruginosa utilizando todas estas linhagens mutantes revelaram que a VgrG3 é a mais importante para a atividade antibacteriana do T6SS, pois apenas o mutante individual ΔvgrG3 teve forte redução na capacidade de matar a P. aeruginosa; a partir do mutante triplo ΔvgrG1-3 houve perda total da competição mediada pelo T6SS; e apenas vgrG3 resgatou a capacidade de competição do mutante sêxtuplo. Ensaios de Western blot foram utilizados para avaliar a secreção de Hcp nos mutantes vgrGs de C. violaceum como um indicativo do funcionamento do T6SS. Os dados indicaram que, dos seis mutantes individuais, apenas ΔvgrG1 e ΔvgrG3 tiveram uma diminuição da secreção de Hcp. A partir da deleção tripla ΔvgrG1-3 não houve mais secreção de Hcp. A ausência de secreção no mutante sêxtuplo foi totalmente revertida na presença de vgrG3 e fracamente recuperada com os outros genes vgrGs, indicando maior relevância de VgrG3. Ensaios de β-galactosidase revelaram baixa atividade promotora de vgrG2 e vgrG6 e uma expressão dependente da fase de crescimento nos promotores de vgrG3 e vgrG4. O vgrG3 foi o gene mais expresso em qualquer condição. Portanto, os dados obtidos neste trabalho indicam pouca redundância entre as seis VgrGs de C. violaceum, uma vez que a VgrG3 possui papel preponderante em relação às outras cinco VgrGs na montagem de um T6SS funcional com atividade antibacteriana.