A análise do interactoma de SCI1 (Stigma/Style Cell Cycle Inhibitor 1) revela possíveis mecanismos de controle da proliferação celular

• Autor(a) principal: Strini, Edward José
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-21052014-103120/
• topic: Nicotiana tabacum; Nicotiana tabacum; BiFC; BiFC; Cell cycle; Ciclo celular; Duplo-Híbrido; Interação proteína-proteína; Nucléolo; Nucleolus; Pistil; Pistilo; Processamento de RNA; Protein-protein interaction; RNA processing; SCI1; SCI1; Yeast two-hybrid

A biologia da reprodução de plantas é um campo de grande interesse, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes). O pistilo é o órgão reprodutivo feminino, composto de estigma, estilete e ovário. Devido à importância central do pistilo no sucesso da reprodução de plantas, faz-se necessário um melhor conhecimento dos genes e processos que regulam seu desenvolvimento e funcionamento. Estudos comparativos da expressão gênica nos órgãos vegetativos e reprodutivos de Nicotiana tabacum revelaram genes de expressão preferencial nos órgãos reprodutivos, entre eles alguns codificando proteínas de função ainda desconhecida. Um destes genes foi caracterizado e denominado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), por apresentar um papel importante no desenvolvimento do estigma/estilete, atuando como um inibidor de ciclo celular tecido-específico (DePaoli et al., 2011). O presente trabalho teve como objetivo estudar os mecanismos moleculares pelos quais NtSCI1 regula o ciclo celular, investigando seus parceiros de interação. Em um ensaio de pull-down, utilizando-se extrato proteico nuclear de estigmas/estiletes de N. tabacum, vários putativos reguladores de ciclo celular foram identificados, sendo a interação entre NtSCI1 e NtCDKG;2 confirmada por BiFC e localizada no nucléolo. Uma biblioteca de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum, no sistema de duplo-híbrido de levedura, foi construída com sucesso. O screening desta biblioteca, utilizando BD-NtSCI1 como \"isca\", permitiu a identificação de vários parceiros de interação com NtSCI1, entre eles: uma helicase de RNA DEAD-BOX, a proteína 14-3-3D2, dois fatores de transcrição (HOMEOBOX-22 e STOREKEEPER), um fator de splicing portador do domínio SWAP, uma quinase de adenosina e uma transposase. As interações entre NtSCI1 e os três primeiros parceiros citados já foram confirmadas por BiFC (observadas no núcleo e nucléolo) e a interação entre NtSCI1 e Nt14-3-3D2 foi confirmada também por co-imunoprecipitação. O envolvimento de NtSCI1 com a regulação do ciclo celular foi corroborado pela interação entre NtSCI1 e a proteína NtCICLINA-L1 (subunidade regulatória de CDKG;2), confirmada por duplo-híbrido e por BiFC, no nucléolo. A interação entre NtSCI1 e NtCICLINA-RELATED também foi confirmada por BiFC. Para entender a dinâmica de NtSCI1 no nucléolo, foi estudada a localização subcelular da proteína de fusão NtSCI1-GFP durante as fases do ciclo celular. NtSCI1-GFP foi observada no nucléolo de células BY-2 em interfase e prófase, desaparecendo na metáfase e anáfase e reaparecendo no nucléolo no final da telófase, mostrando que a presença de NtSCI1 na célula é controlada pelo ciclo celular. A construção de uma primeira versão do interactoma de NtSCI1 mostrou seu envolvimento direto e indireto com proteínas relacionadas ao metabolismo de RNAs, controle da transcrição e regulação do ciclo celular. Estes resultados sugerem que NtSCI1 possa atuar no controle do ciclo celular de forma não canônica, por meio de múltiplos processos paralelos que interconectam aspectos da regulação da transcrição e o processamento de RNAs com o controle do ciclo celular.