Ferro lábil: propriedades fundamentais e reatividade com peroxinitrito no modelo celular RAW 264.7
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2023 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
Texto Completo: | https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-14072023-153350/ |
Resumo: | O Ferro Lábil (LIP) representa uma fonte celular universal, regulável e fundamental de ferro (II) usada para incorporação como o cofator de apo-ferro proteínas nascentes. Apesar dessa alegada função de chaperona de ferro, a identidade de LIP ainda é desconhecida, sendo sua existência baseada na propriedade de ser complexado por quelantes de elevada afinidade por Fe(II), o que distingue LIP do ferro ligado a grupos heme e clusteres de enxofre. Essa propriedade também tem sido explorada para estudar suas reações químicas e propriedades biológicas. Recentemente, em investigações da oxidação dependente de peroxinitrito em células RAW 264.7, observamos que a quelação de LIP aumenta a oxidação de um indicador fluorescente e concluímos que LIP interage com peroxinitrito (ou derivados radicalares de peroxinitrito) e diminui seu poder oxidante. O presente estudo é dividido em dois capítulos. No primeiro, nós abordamos propriedades fundamentais da reação entre LIP e peroxinitrito usando a mesma metodologia de fluorescência e modelo celular e constatamos que a reação entre LIP e peroxinitritro é provavelmente direta, rápida (constante de velocidade na faixa entre 106-107 M-1s-1) e com características catalíticas. Reunidas, essas informações sugerem que LIP representa um sistema peroxinitrito redutase em células RAW 264.7. No segundo capítulo, nós criamos um modelo de que LIP esteja ligado a um constituinte celular C na forma de um complexo genérico CLIP e modificamos metodologia originalmente usada para quantificação de LIP para acessar a constante termodinâmica de afinidade entre LIP e C (Kd) bem como a concentração total de C. Os resultados sugerem que as concentrações totais de LIP e de seu ligante (C) não ultrapassem 3 µM em células RAW 264.7 e que estejam ligados fortemente (Kd ≈ 10-2 µM), existindo predominantemente como CLIP. Essas informações confrontam as hipóteses existentes de que LIP seja o complexo hexaaqua Fe(II) ou um complexo com Glutationa (GSFe) e podem ajudar na identificação de LIP. |
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Ferro lábil: propriedades fundamentais e reatividade com peroxinitrito no modelo celular RAW 264.7Labile iron pool: fundamental properties and reactivity with peroxynitrite in the RAW 264.7 cell modelCinéticaFerro lábilKineticsLabile iron poolPeroxinitritePeroxinitritoPropriedades termodinâmicasThermodynamic propertiesO Ferro Lábil (LIP) representa uma fonte celular universal, regulável e fundamental de ferro (II) usada para incorporação como o cofator de apo-ferro proteínas nascentes. Apesar dessa alegada função de chaperona de ferro, a identidade de LIP ainda é desconhecida, sendo sua existência baseada na propriedade de ser complexado por quelantes de elevada afinidade por Fe(II), o que distingue LIP do ferro ligado a grupos heme e clusteres de enxofre. Essa propriedade também tem sido explorada para estudar suas reações químicas e propriedades biológicas. Recentemente, em investigações da oxidação dependente de peroxinitrito em células RAW 264.7, observamos que a quelação de LIP aumenta a oxidação de um indicador fluorescente e concluímos que LIP interage com peroxinitrito (ou derivados radicalares de peroxinitrito) e diminui seu poder oxidante. O presente estudo é dividido em dois capítulos. No primeiro, nós abordamos propriedades fundamentais da reação entre LIP e peroxinitrito usando a mesma metodologia de fluorescência e modelo celular e constatamos que a reação entre LIP e peroxinitritro é provavelmente direta, rápida (constante de velocidade na faixa entre 106-107 M-1s-1) e com características catalíticas. Reunidas, essas informações sugerem que LIP representa um sistema peroxinitrito redutase em células RAW 264.7. No segundo capítulo, nós criamos um modelo de que LIP esteja ligado a um constituinte celular C na forma de um complexo genérico CLIP e modificamos metodologia originalmente usada para quantificação de LIP para acessar a constante termodinâmica de afinidade entre LIP e C (Kd) bem como a concentração total de C. Os resultados sugerem que as concentrações totais de LIP e de seu ligante (C) não ultrapassem 3 µM em células RAW 264.7 e que estejam ligados fortemente (Kd ≈ 10-2 µM), existindo predominantemente como CLIP. Essas informações confrontam as hipóteses existentes de que LIP seja o complexo hexaaqua Fe(II) ou um complexo com Glutationa (GSFe) e podem ajudar na identificação de LIP.The Labile Iron pool (LIP) represents a universal, regulated, and fundamental cellular source of iron(II) used for incorporation as the cofactor of nascent apo-iron proteins. Despite this alleged iron chaperone function, the identity of LIP is still unknown, and its existence is based on the property of being complexed by chelators with high affinity for Fe(II), which distinguishes LIP from heme- and sulfur-clusters iron. This property has also been exploited to study its chemical reactions and biological properties. Recently, in investigations of peroxynitrite-dependent oxidation in RAW 264.7 cells, we observed that LIP chelation increases the oxidation of a fluorescent indicator and concluded that LIP interacts with peroxynitrite (or peroxynitrite derived radicals) and decreases its oxidizing power. This study is divided into two chapters. In the first, we addressed fundamental properties of the reaction between LIP and peroxynitrite using the same fluorescence methodology and cell model and found that the reaction between LIP and peroxynitrite is probably direct, fast (rate constant within 106-107 M-1s-1) and with catalytic characteristics. Together, these observations suggest that the LIP represents a constitutive peroxynitrite reductase system in RAW 264.7 cells. In the second chapter, we model that LIP is linked to a cellular constituent C in the form of a generic CLIP complex and modify a methodology originally used for LIP quantification to assess both the thermodynamic affinity constant between LIP and C (Kd) as well as the total concentration of C. The results suggest that the total concentrations of LIP and its ligand (C) do not exceed 3 µM in RAW 264.7 cells and that they are tightly bound togeter (Kd ≈ 10-2 µM), existing predominantly as CLIP. This information confronts the existing hypotheses that LIP is the hexaaqua Fe(II) complex or a complex with Glutathione (GSFe) and can help the identification of LIP.Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPToledo Junior, José CarlosCondeles, André Luís2023-05-25info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttps://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-14072023-153350/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPLiberar o conteúdo para acesso público.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2023-08-21T18:53:46Zoai:teses.usp.br:tde-14072023-153350Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212023-08-21T18:53:46Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false |
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O Ferro Lábil (LIP) representa uma fonte celular universal, regulável e fundamental de ferro (II) usada para incorporação como o cofator de apo-ferro proteínas nascentes. Apesar dessa alegada função de chaperona de ferro, a identidade de LIP ainda é desconhecida, sendo sua existência baseada na propriedade de ser complexado por quelantes de elevada afinidade por Fe(II), o que distingue LIP do ferro ligado a grupos heme e clusteres de enxofre. Essa propriedade também tem sido explorada para estudar suas reações químicas e propriedades biológicas. Recentemente, em investigações da oxidação dependente de peroxinitrito em células RAW 264.7, observamos que a quelação de LIP aumenta a oxidação de um indicador fluorescente e concluímos que LIP interage com peroxinitrito (ou derivados radicalares de peroxinitrito) e diminui seu poder oxidante. O presente estudo é dividido em dois capítulos. No primeiro, nós abordamos propriedades fundamentais da reação entre LIP e peroxinitrito usando a mesma metodologia de fluorescência e modelo celular e constatamos que a reação entre LIP e peroxinitritro é provavelmente direta, rápida (constante de velocidade na faixa entre 106-107 M-1s-1) e com características catalíticas. Reunidas, essas informações sugerem que LIP representa um sistema peroxinitrito redutase em células RAW 264.7. No segundo capítulo, nós criamos um modelo de que LIP esteja ligado a um constituinte celular C na forma de um complexo genérico CLIP e modificamos metodologia originalmente usada para quantificação de LIP para acessar a constante termodinâmica de afinidade entre LIP e C (Kd) bem como a concentração total de C. Os resultados sugerem que as concentrações totais de LIP e de seu ligante (C) não ultrapassem 3 µM em células RAW 264.7 e que estejam ligados fortemente (Kd ≈ 10-2 µM), existindo predominantemente como CLIP. Essas informações confrontam as hipóteses existentes de que LIP seja o complexo hexaaqua Fe(II) ou um complexo com Glutationa (GSFe) e podem ajudar na identificação de LIP. |
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