Septina de Chlamydomonas reinhardtii: estudos com foco em sua expressão e função

• Autor(a) principal: Ciol, Heloísa
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-11092017-084455/
• topic: Chlamydomonas reinhardtii; Chlamydomonas reinhardtii; Septin; Septina

Septinas fazem parte de uma família de proteínas de ligação ao nucleotídeo guanina e já foram encontradas em diversos eucariontes, mas nunca em plantas. Essas proteínas têm sido descritas como atuantes na citocinese, estruturação celular e exocitose, mas pouco se conhece do seu modo de ação. Além disso, as septinas mostraram-se capazes de se polimerizar em heterofilamentos altamente organizados, a partir da interação com outras septinas, mas as referências à existência e funcionalidade de homofilamentos de septinas permanecem escassas e controversas. Este trabalho visou caracterizar a função da septina da alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii, um eucarionte modelo que divergiu há muito de um ancestral comum a plantas e metazoários, e que possui uma única septina, diferente dos demais eucariontes estudados até o momento. Para tal, foram realizados ensaios de duplo híbrido para detecção de possíveis proteínas parceiras à septina de C. reinhardtii, além de análise de expressão gênica em diferentes pontos do ciclo celular por PCR quantitativo (qPCR), silenciamento gênico por micro-RNA artificial de interferência e imunolocalização por microscopia confocal. Os ensaios de duplo híbrido retornaram duas possíveis proteínas parceiras de interação à septina de Chalmydomonas reinhardtii (CrSept) – S-Adenosyl-Homocysteine-Hydrolase (CrSAHH) e Subtilase-like-Serino-Protease (esporangina) – ambas relacionada à estrutura flagelar. A interação entre CrSept e CrSAHH não foi validada através das técnicas de pulldown e crosslinking, porém, os experimentos de imunolocalização da proteína in situ mostraram uma grande concentração de CrSept na base flagelar durante as fases G0, e G1, com mudança no perfil de localização para o citoplasma durante as fases S e M do ciclo celular, evidenciando uma participação da septina na estrutura flagelar e não excluindo a possibilidade de uma interação in vivo entre CrSept e CrSAHH. Análises do nível de expressão gênica de CrSept mostraram uma tendência de maior expressão do gene da septina durante o período claro, com redução na fase escura do ciclo celular, resultados que se assemelham aos observados pela análise qualitativa, por western blot, da expressão da proteína ao longo do ciclo celular. Os experimentos de silenciamento gênico, por fim, mostraram um possível fenótipo relacionado à redução de mRNA de CrSept, não observado no grupo controle. Estes resultados mostram que a CrSept possui caráter estrutural na alga verde C. reinhardtii, podendo atuar como suporte para outras proteínas durante a fase de crescimento celular. Além disso, localizações pontuais por toda a célula durante a fase de divisão celular sugerem que a CrSept desempenha um importante papel na manutenção da estrutura celular para a conclusão da divisão celular.