Caracterização estrutural e funcional de um fator de crescimento endotelial vascular, VEGF, da peçonha da serpente Crotalus durissus collilineatus

• Autor(a) principal: Ferreira, Isabela Gobbo
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-23112017-115304/
• topic: Angiogênese e espectrometria de massas; Angiogenesis and mass spectrometry; Crotalus durissus collilineatus; Crotalus durissus collilineatus; Peçonha de serpente; Snake venom; VEGF; VEGF

As peçonhas de serpentes são consideradas ricas fontes de componentes com importantes ações farmacológicas. Estudar seus componentes permite esclarecer a patogenia do envenenamento e identificar moléculas com potenciais aplicações biotecnológicas. As serpentes da espécie Crotalus durissus habitam diversas regiões do Brasil e suas peçonhas são compostas de grande quantidade de proteínas (cerca de 95%), carboidratos, cátions metálicos, aminas biogênicas, nucleosídeos, componentes não enzimáticos, aminoácidos livres e uma pequena fração lipídica. Muitos componentes ainda não foram isolados, embora alguns já tenham sido identificados em análises ômicas (transcriptoma e proteoma), como é o caso do VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular) identificado por estas técnicas na peçonha de Crotalus durissus collilineatus (C.d.c). Os VEGFs são homodímeros não enzimáticos com massas moleculares de 20 a 30 kDa, para o dímero, e de 13 a 16 kDa, para o monômero. Eles desempenham o papel principal na angiogênese (crescimento de novos vasos). No entanto, seu papel no envenenamento ainda não está elucidado. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo isolar e elucidar os aspectos estruturais e funcionais parciais, de um VEGF da peçonha da serpente C.d.c. A peçonha foi inicialmente submetida a uma análise por LC-MS para um conhecimento geral dos seus componentes. Em seguida, foi fracionada por cromatografia líquida de fase reversa em sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) e, posteriormente, todas as 43 frações obtidas foram submetidas ao ELISA para identificação do VEGF. As frações 23, 24 e 25 foram positivas para VEGF e, por isso, escolhidas para serem estudadas. Estas frações foram recromatografadas por meio de três protocolos (troca catiônica, fase reversa e troca aniônica). Após os fracionamentos, todas as subfrações foram submetidas ao ELISA para identificação do VEGF e à eletroforese em gel de poliacrilamida para a análise da composição das mesmas. Em seguida, essas amostras foram reduzidas, alquiladas e digeridas com tripsina e submetidas a ensaios de espectrometria de massas (ESI-Q-TOF e PMF), para identificar peptídeos trípticos de VEGF e, as que mostraram maior pureza na eletroforese, foram analisadas por sequenciamento amino-terminal, a fim de elucidar sua estrutura primária. Nestes estudos foram identificados um Fator de crescimento de fibroblasto (FGF) e duas isoformas de VEGF. A cromatografia em coluna de troca iônica (HiTrap QXL) foi a mais efetiva na purificação dos compostos das frações 23, 24 e 25. As 6 subfrações obtidas, após confirmação da presença de VEGF pelo ELISA, eletroforese e espectrometria de massas, foram submetidas a uma análise de reconhecimento do VEGF pelo soro anticrotálico comercial por meio do ELISA e o VEGF foi reconhecido com alta afinidade pelo soro. Em seguida, essas amostras foram analisadas por ELISA com anticorpo anti-FGF a fim de confirmar a presença do FGF, porém, este não foi reconhecido nas amostras pelo anticorpo, nas concentrações utilizadas. As frações contendo VEGF, denominado de CdcVEGF, foram submetidas aos ensaios funcionais. No ensaio de angiogênese in vitro, no qual se analisa a indução da formação de tubos em Matrigel® pelas células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVECs), todas as 6 subfrações induziram a angiogênese, confirmando que mantiveram sua atividade após os fracionamentos e dentre estas, a subfração denominada de 24-QXL3 foi a mais potente, mostrando uma indução da formação dos tubos ainda mais potente que o controle positivo (bFGF). No ensaio in vitro de migração de células mononucleares de sangue periférico humano (quimiotaxia em câmara de boyden), os CdcVEGFs não alteraram significativamente a migração das células, nas concentrações testadas. Os dados obtidos neste trabalho ampliam o conhecimento sobre a composição da peçonha de C.d.c, além de desenvolver um novo protocolo para isolamento de VEGF e possibilitar sua caracterização. Adicionalmente, foi possível a identificação de um novo FGF, o qual ainda não havia sido identificado na peçonha de C.d.c.