Secreção de Gaussia luciferase como indicador de atividade de caspase-3/7 em resposta ao tratamento com AdCDKN2AIRESp53 em glioblastoma multiforme.

• Autor(a) principal: Oliveira, Daniel Vieira Conde
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42134/tde-18022019-101454/
• topic: Adenovirus; Adenovírus; Cancer; Câncer; Gene therapy; Genes supressores de tumor; Luciferase; Luciferase; Terapia gênica; Tumor suppressor genes

Este trabalho descreve a remediação simultânea de dois genes supressores de tumor, CDKN2A e p53, em três linhagens celulares derivadas de glioblastoma multiforme: U87 (CDKN2A-/-, p53wt/wt), U251 (CDKN2A-/-, p53mut/mut) e T98G (CDKN2A-/-, p53mut/mut). A entrega gênica foi mediada por vetor adenoviral bicistrônico contendo o cassete CDKN2AIRESp53, capaz de expressar as duas proteínas simultaneamente. Vetores monocistrônicos também foram testados (AdCDKN2A e Adp53). Visando detectar apoptose, as linhagens receberam o sensor de atividade de caspase-3/7 GFP-DEVD-ssGLUC por transdução lentiviral. Este possui Gaussia luciferase (GLUC) C-terminal, que é secretada após ativação de caspases e pode ser dosada no sobrenadante. Após a marcação, realizaram-se ensaios de viabilidade celular, proliferação, formação de colônias, senescência, ciclo celular e dosagem de GLUC após remediação dos genes supressores de tumor nas linhagens GBMDEVD-GLUC. Com ensaio de viabilidade, observou-se efeito citotóxico do vetor bicistrônico AdCDKN2AIRESp53 maior que a soma dos obtidos com cada tratamento monocistrônico. No ensaio de senescência, o vetor AdCDKN2A resultou na maior indução do fenótipo senescente em todas as linhagens, seguido por Adp53, enquanto AdCDKN2AIRESp53 produziu resultados similares a um desses dois perfis em cada linhagem. Dosagem de GLUC no sobrenadante foi usada como indicador para atividade de caspase-3/7 após tratamento com os vetores supressores de tumor. O controle AdLacZ resultou em atividade de GLUC maior que nas amostras sem vírus (mock), enquanto tratamento com AdCDKN2A obteve resultados maiores que o controle em 72 h nas três linhagens. O vetor AdCDKN2AIRESp53 alcançou, inesperadamente, resultados variados em 72 h. Os dados obtidos neste trabalho indicam que a remediação simultânea de CDKN2A e p53 possui notável ação antiproliferativa tumoral, podendo levar à morte ou à senescência celular. Também é apontado que o sensor de caspase-3/7 GFP-DEVD-ssGLUC é robusto, mas detecta não apenas a indução de apoptose, mas a combinação de todos os processos ativadores de caspases em uma amostra.