Transferência transiente de genes em embriões de galinha por meio da biolística

• Autor(a) principal: Ribeiro, Luciana de Andrea
• Data de Publicação: 1999
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20200111-132026/
• topic: BIOLÍSTICA; EMBRIÕES; GALINHAS; TRANSFERÊNCIA DE GENES

A biolística é um método físico para a introdução de ácidos nucleicos e outras moléculas no interior de células e tecidos, devido à aceleração de micropartículas a altas velocidades. Esta técnica tem sido amplamente utilizada para a transferência de genes, em uma variedade de espécies animais, devido a alguns fatores como: baixa manipulação do alvo a ser bombardeado, simplicidade e rapidez no processo de bombardeamento, liberação de altas doses de DNA em alvos específicos, bombardeamento simultâneo de muitas células e possibilidade de co-transformação com dois ou mais plasmídeos. Este trabalho descreve o desenvolvimento e a otimização da biolística para a transferência de genes em embriões de galinha. Diferentes condições de bombardeamento foram testadas, visando a obtenção de altas taxas de transformação, máximo número de células transformadas e reduzido dano ao tecido bombardeado. Os parâmetros avaliados foram: tipo e tamanho das micropartículas, distância percorrida pelo DNA-micropartículas até o embrião, posicionamento dos embriões em relação ao centro do cone de dispersão das partículas, pressão de gás hélio e nível de vácuo na câmara de bombardeamento. As condições de bombardeamento foram otimizadas para a transformação de embriões de galinha, dentro do próprio ovo (bombardeamento in situ) ou cultivados em meio de cultura (bombardeamento in vitro). As condições ótimas para o bombardeamento in situ foram obtidas com: partículas de ouro de 1,5 a 3,0 μm de diâmetro, distância de 11cm percorrida pelo DNA-micropartículas até o embrião, posicionamento dos embriões a 1cm de distância do centro do cone de dispersão das partículas, 600 psi de gás hélio e 600 mmHg de vácuo. Sob estas condições, a eficiência de transformação e a taxa de sobrevivência foram, 68,7% e 31,2%, respectivamente. No bombardeamento in vitro, as condições ótimas foram: partículas de ouro de 1,5 a 3,0 μm de diâmetro, distância de 8 cm percorrida pelo DNA-micropartículas até o embrião, posicionamento dos embriões a 0,5 cm de distância do centro do cone de dispersão das partículas, 800 psi de gás hélio e 500 mmHg de vácuo. A eficiência de transformação e a taxa de sobrevivência foram 98,5% e 25,4%, respectivamente. Estes resultados demonstraram a viabilidade da biolística para a introdução de genes exógenos em embriões de galinha.