Síntese e caracterização de prolactina de camundongo (mPRL) e deu seu análogo (S177D-mPRL)

• Autor(a) principal: Suzuki, Miriam Fussae
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85131/tde-29062011-154905/
• topic: antagonista; CHO; CHO; hormônio recombinante; mPRL; mPRL; prolactin; prolactina

A prolactina é um neurohormônio que faz parte da superfamília das citocinas e está envolvida em inúmeros processos biológicos. Devido à sua ação endócrina, autócrina e parácrina, a prolactina está muitas vezes relacionada ao desenvolvimento de patogenias humanas como carcinomas e doenças autoimunes. Considerando-se que: a) diferença de 41% encontrada na sequência de aminoácidos da prolactina de camundongo em relação à humana, b) diferenças na glicosilação, fosforilação, e ligação ao receptor e, c) o fato que os modelos animais utilizados em ensaios in vivo com prolactina humana são geralmente ratos ou camundongos (modelos heterólogos), fica evidente que esses fatores podem interferir na interpretação dos resultados. Portanto, experimentos em sistemas homólogos seriam desejáveis. Esse trabalho descreve a obtenção pela primeira vez da mPRL no espaço periplásmico bacteriano, portanto na sua forma autêntica, ou seja, sem a metionina inicial, com expressão de 0,1 ± 13,2% g/mL/A600. Para isso um vetor de expressão baseado no promotor lPL foi construído e utilizado como promotor constitutivo, com ativação a 37° C. Um processo de fermentação em biorreator, com rendimentos de expressão de até 2,5 g/mL, e um processo de purificação com três etapas: concentração e purificação por hidrofobicidade (Phenyl Sepharose CL-4B) seguida por HPLC de fase reversa e HPSEC, foram também desenvolvidos. A mPRL purificada foi caracterizada por técnicas físico-químicas e biológicas em comparação com o padrão de referência da mPRL recombinante do Instituto Nacional de Saúde (NIH, EUA). A atividade biológica foi analisada e sua potência calculada foi de 33,9 ± 1,4 UI/mg. O mesmo vetor foi utilizado para a expressão do antagonista S177DmPRL, mas o baixo nível de expressão obtido inviabilizou a sua produção no espaço periplásmico de bactérias. Como alternativa, optamos por produzir essa proteína em células CHO e clones com expressão da ordem de 1 g/mL/dia foram obtidos. Com a expressão tanto da mPRL autêntica, como do S177D-mPRL, está aberto o caminho para o desenvolvimento dos estudos que envolvam modelos animais onde a mPRL e seu antagonista sejam fatores relevantes a serem considerados.