Clonagem e expressão da glucocerebrosidase humana em células de ovário de hamster chinês (CHO).

• Autor(a) principal: Novo, Juliana Branco
• Data de Publicação: 2010
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-19082010-162050/
• topic: Amplificação de genes; Células CHO; CHO cells; DHFR; DHFR; Dicistronic expression; Doença de Gaucher; Expressão dicistrônica; Expressão gênica; Gaucher\'s disease; Gene expression; Genes amplification; Glicopeptídeos; Glicoproteínas; Glucocerebrosidase; Glucocerebrosidase; Glycopeptides; Glycoproteins; Lisossomos; Lysosomes; Ovário; Ovary; Proteínas recombinantes; Recombinant proteins

Deficiência na enzima lisossomal glucocerebrosidase (GCR) resulta na doença de Gaucher. O tratamento atual consiste na administração da enzima exógena, produzida em células CHO. Porém, o medicamento disponível no mercado é extremamente custoso. Neste trabalho, propusemos a clonagem e a expressão da GCR humana em células CHO, visando a obtenção de um clone celular produtor para viabilizar a produção futura da enzima, a um custo menor, no Instituto Butantan. A expressão estável da GCR recombinante foi obtida a partir da transfecção de células CHO-dhfr- com o plasmídeo pED de expressão em células de mamíferos contendo o cDNA da GCR, seguido de amplificação gênica por MTX. A GCR foi detectada no extrato celular (~ 64 kDa) e secretada para o sobrenadante (63-69 kDa) em ensaios de western blotting, usando o anticorpo policlonal anti-GCR gerado neste trabalho. A enzima secretada hidrolisou o substrato 4-MUG e a sua produtividade foi estimada em 5,14 pg/célula/dia para o melhor subclone produtor, selecionado para a produção futura da GCR em larga escala.