Desenvolvimento da reação sítio- específica de PEGuilação do FabC11:Stx1/Stx2

• Autor(a) principal: Henrique, Izabella de Macedo
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9142/tde-12122023-115315/
• topic: Anticorpo monoclonal; Bioconjugação; Bioconjugation; HUS; Monoclonal antibody; monoPEGuilação; monoPEGylation; Shiga Toxin; SHU; Toxina de Shiga

A Síndrome Hemolítica Uremica (SHU) é uma das principais causas da injúria renal aguda na infância, essa síndrome é associada à toxina de Shiga (Stx), o principal fator de virulência da STEC. As terapias atuais para SHU apenas auxiliam na redução dos sintomas, mas não são específicas para o combate da Stx. O anticorpo FabC11:Stx1/Stx2 foi capaz de neutralizar esta toxina. Neste estudo foi realizada a modificação do anticorpo por PEGuilação sítio dirigida (m-PEG-mal 40 kDa), com intuito de aprimorar a farmacocinética desse candidato a biofármaco que demonstrou uma meia-vida curta em estudos anteriores. Para o desenvolvimento do projeto foram testados diferentes parâmetros de cultivo em sistema descontínuo para produção de FabC11:Stx1/Stx2 recombinante em agitador orbital, a etapa de PEGuilação com mPEG-mal 20 e 40 kDa (1:15 Fab: PEG), a etapa de purificação do conjugado e sua caracterização bioquímica e a avaliação da sua atividade neutralizante in vitro. O cultivo em agitador orbital mostrou que o meio terrific broth com adição de 5 g/L de glicose promoveu o aumento de 58% na produtividade de FabC11:Stx1/Stx2 ao final da indução. Dois protocolos de PEGuilação e purificação foram testados, o segundo modelo apresentou um rendimento final na produção do FabC11:Stx1/Stx2 monoPEGuilado de 58%, nessa reação de PEGuilação, o Fab foi reduzido com 0,1 mM de TCEP, as pontes de dissulfeto foram reconstituídas por 24 h e a conjugação ocorreu na proporção de 1:15 (Fab:PEG) e a purificação foi realizada por troca catiônica em tampão MES (10 mM) pH 6,7 e gradiente de NaCl de 1 M. O FabC11:Stx1/Stx2 purificado foi analisado por dicroísmo circular, espectrometria de massas e estudo in vitro. A espectrometria de massas não foi capaz de identificar o aminoácido em que a conjugação ocorreu, porém o dicroísmo circular demonstrou altíssima semelhança (99%) ao Fab nativo, e nos testes in vitro também foram observados comportamentos semelhantes na atividade funcional do FabC11:Stx1/Stx2 antes e após a PEGuilação. A caracterização demonstra que a PEGuilação não ocasionou alterações na estrutura secundária e funcional doanticorpo. Dessa forma, apresentamos um anticorpo recombinante PEGuilado (FabC11:Stx1/Stx2) como uma molécula promissora para o tratamento de SHU associada a Stx.