Clonagem, expressão e caracterização de três enzimas hidrolíticas de Aspergillus fumigatus envolvidas na desconstrução de bagaço de cana-de-açúcar

• Autor(a) principal: Bernardi, Aline Vianna
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-14122021-122829/
• topic: Aspergillus fumigatus; Aspergillus fumigatus; Cellobiohydrolase; Celobiohidrolase; Endoglucanase; Endoglucanase; Lignocellulose; Lignocelulose; Xilanase; Xylanase

A lignocelulose representa a fonte de carbono renovável mais abundante da Terra, a partir da qual bioprodutos de alto valor agregado, como o etanol 2G, podem ser obtidos. Contudo, devido à elevada recalcitrância imposta pela complexa associação entre celulose, hemicelulose e lignina, grandes quantidades de enzimas do tipo CAZymes são necessárias para a conversão eficiente em açúcares fermentáveis. Os preços elevados dessas enzimas correspondem hoje a mais de 15% dos custos totais envolvidos no processamento da biomassa, sendo portanto um dos principais entraves para a implementação de biorrefinarias lignocelulósicas em larga escala e de forma economicamente viável. A bioprospecção de enzimas mais robustas para aplicações industriais pode contribuir para a otimização dos coquetéis enzimáticos, maximizando os rendimentos dos produtos e, simultaneamente, reduzindo os custos do processo. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar as propriedades bioquímicas e cinéticas de três enzimas hidrolíticas de A. fumigatus Af293 - uma endoglucanase GH7 (Af-EGL7), uma celobiohidrolase GH6 (AfCel6A) e uma xilanase GH10 (Af-XYLA) - as quais foram identificadas pelo nosso grupo de pesquisa em secretoma e transcriptoma, quando o fungo foi cultivado na presença de bagaço de cana-de-açúcar explodido (SEB). Para tanto, o gene Af-egl7 foi clonado nos respectivos vetores pET-28a(+) e pPICZαA para expressão heteróloga em E. coli RosettaTM (DE3) pLysS e P. pastoris X-33. Os genes Afcel6A e Af-xylA, por sua vez, foram expressos somente em P. pastoris X-33. A endoglucanase Af-EGL7 produzida em dois sistemas de expressão diferentes apresentou propriedades enzimáticas bem distintas, principalmente em termos de estabilidade e eficiência catalítica. As condições ótimas de temperatura e pH foram as mesmas em ambos os casos - 55 ºC e pH 5,0 - assim como a tolerância a diferentes aditivos presentes no meio reacional. Embora substancialmente menos ativa, a Af-EGL7 produzida em bactéria foi capaz de atuar sinergicamente com o coquetel Celluclast®1.5L durante a degradação de SEB, e, assim, promover aumentos consideráveis nos percentuais de açúcares redutores liberados. Similarmente, a Af-EGL7 expressa em P. pastoris exibiu sinergismo com o coquetel comercial sobre esse e outros resíduos lignocelulósicos. A celobiohidrolase AfCel6A exibiu atividade máxima entre 55-60 ºC e pH 5,5-6,0. Essa enzima apresentou estabilidade considerável em diferentes condições de temperatura e pH, além de alta resistência à inibição por glicose em concentrações de até 250 mM. A AfCel6A atuou em sinergia tanto com o coquetel quanto com a Af-EGL7 na degradação de CM-Celulose e biomassas mais complexas, o que resultou em rendimentos de hidrólise muito superiores em comparação ao controle. Para a xilanase Af-XYLA, o melhor desempenho foi alcançado a 80 ºC e na faixa de pH de 5,0-7,0. Os parâmetros cinéticos da Af-XYLA sobre xilana foram muito superiores aos reportados na literatura para outras xilanases GH10 fúngicas. A Af-XYLA demonstrou elevada tolerância aos açúcares glicose e xilose em concentrações de até 250 mM, além de estabilidade considerável a diferentes temperaturas e pH. Similarmente ao observado para as duas celulases recombinantes, o alto grau de sinergismo entre a Af-XYLA e as celulases comerciais intensificou substancialmente a liberação de açúcares redutores a partir de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado. Juntos, os resultados obtidos apontaram essas três enzimas recombinantes como potenciais alvos para aplicações em biorrefinarias lignocelulósicas.