Avaliação do padrão de secreção e morfologia de vesículas extracelulares derivadas de células-tronco da membrana amniótica canina

• Autor(a) principal: Karam, Rafael Garcia
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-28012020-105305/
• topic: Exosome; Exossomos; Mesenchymal; Mesenquimais; Microvesicles; Microvesículas

O estudo das vesículas extracelulares (VEs) secretadas pelas células-tronco mesenquimais (CTM) em cultura pode ajudar a entender de maneira mais concisa o seu funcionamento. Este trabalho tem como objetivo comparar a quantidade e tamanho das vesículas extracelulares pequenas (até 150nm) derivadas de célulastronco da membrana amniótica canina. Foram isoladas células da membrana amniótica de cadelas, cultivadas e caracterizadas. Para responder ao nosso objetivo, o número de células foi normalizado em cada passagem. As CTM isoladas apresentaram uma curva de crescimento crescente até atingir a segunda passagem, seguindo-se uma diminuição até a quinta passagem. As células foram diferenciadas em tecido adipogênico, condrogênico e osteogênico. Análises por citometria de fluxo mostraram que as CTM foram positivas para marcadores mesenquimais CD90 (62,6%) e CD105 (89,5%) e negativas para marcadores hematopoiéticos CD34 (5,2%) e CD45 (3,1%). Para a análise de VEs, as células em diferentes passagens (P0-P2) foram cultivadas até atingir 80% de confluência, em seguida, o meio foi substituído por meio livre de VEs (previamente ultracentrifugado). Após 48h, o meio de cultura foi removido e centrifugado para isolar as VEs, seguido por análise de nanosight para medir a concentração e o tamanho das VEs. A caracterização por western blot também foi realizada. As VEs foram positivas para Alix e negativos para Citocromo C. Os resultados demonstraram que a concentração nessas diferentes passagens analisadas foi aumentada em P0 comparado a P1 e P2 (P0=1,2x109±71220315, P1=3,8x108±54173333, e P2=3,3x108±170128967). No entanto, não foram encontradas diferenças no tamanho das VEs (P0 = 132nm, P1 = 130nm e P2 = 120nm). Estes resultados demonstram que a passagem inicial é enriquecida de VEs quando comparada com as passagens posteriores, indicando um efeito de deficiência in vitro no padrão de secreção das VEs.