Análise comparativa da PCR em tempo real, nested PCR e teste imunocromatográfico em amostras de sangue processadas em pool, como plataforma de diagnóstico molecular e sorológico de malária em larga escala

• Autor(a) principal: Lima, Giselle Fernandes Maciel de Castro
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5134/tde-02082011-163505/
• topic: Malaria; Malária; Plasmodium/diagnosis; Plasmodium/diagnóstico; Polimerase chain reaction; Reação em cadeia da polimerase

O diagnóstico da malária tem como teste de referência a gota espessa, porém é consenso que é preciso adotar alternativas em situações específicas, com técnicas mais sensíveis e que possam ser aplicadas no processamento de grande número de amostras, como estudos clínicos, epidemiológicos ou triagem de doadores em bancos de sangue. Com a finalidade de formar uma plataforma de diagnóstico para malária em amostras agrupadas em pools, foi realizada análise comparativa da PCR em tempo real, a nested PCR e um teste rápido específico para detecção de anticorpos contra P.falciparum e P. vivax, com intuito de reduzir o número de ensaios, com custo relativamente baixo. Foram utilizadas 50 amostras de sangue positivas para Plasmodium, de acordo com a prevalência das espécies no Brasil (P. vivax 75%, P. falciparum 22% e P. malariae 3%), com diagnóstico realizado pelo método padrão ouro. Adicionalmente, 48 amostras de sangue negativas para Plasmodium foram selecionadas para controle negativo e confecção de 15 pools, contendo amostras positivas e negativas. Quatro das amostras negativas para malária eram positivas para outras doenças. Tanto as amostras positivas como as negativas foram submetidas individualmente aos ensaios de PCR em tempo real, nested PCR e teste imunocromatográfico SD Bioline Pf/Pv para detecção de malária. Um teste de PCR convencional foi incluído a fim de testar a qualidade do DNA, mediante amplificação de uma sequência do gene humano da -globina como controle interno. Posteriormente as amostras foram analisadas em pools pelos ensaios moleculares e sorológicos. Nos testes individuais, 45/49 amostras foram positivas para Plasmodium pela PCR em tempo real, com Sensibilidade de 91,84%, e Especificidade (48/48) de 100,00%; 46/49 amostras detectaram Plasmodium pela nested PCR, com Sensibilidade de 93,88%, e Especificidade (12/12) de 100,00%; 32/46 amostras foram reagentes no teste sorológico SD Bioline Pf/Pv, com Sensibilidade de 69,56%, e Especificidade (10/10) de 100,00%. Nos ensaios com amostras agrupadas, 13 pools (86,66%) foram positivos pela PCR em tempo real; a nested PCR também obteve positividade nos mesmos 13 pools (86,66%). O teste imunocromatográfico SD Bioline apresentou Sensibilidade de 73,33% considerando o diagnóstico pela gota espessa. Tanto a PCR em tempo real como a nested PCR apresentaram boa sensibilidade e especificidade, seja nas amostras clínicas analisadas individualmente ou em pools, diferentemente do teste sorológico SD Bioline. Ambas as metodologias moleculares apresentaram desempenho semelhante, com bons resultados de acurácia e indicadores de validade, como Sensibilidade, Especificidade, Valor Preditivo Positivo e Negativo. Considerando-se as vantagens inerentes à PCR em tempo real, como rapidez, processamento em sistemas fechados e dispensa de eletroforese após amplificação, este método deve ser indicado como primeira escolha para diagnóstico de malária em grande número de amostras, seguido da nested PCR para diferenciação de espécies de Plasmodium. O teste sorológico, que é específico para detecção de anticorpos contra P. vivax e P. falciparum, pode ser indicado apenas como método complementar no diagnóstico de malária