Caracterização de isolados de Clostridium perfringens de ruminantes

• Autor(a) principal: Miyashiro, Simone
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-16092014-155341/
• topic: Clostridium perfringens; Clostridium perfringens; Alpha toxin; Enterotoxaemia; Enterotoxemia; Ruminantes; Ruminants; Toxina alfa

C. perfringens é uma bactéria anaeróbia presente no intestino delgado do homem e animais em equilíbrio e, sob a ação de alguns fatores predisponentes como mudança brusca de alimentação ou super alimentação, stress no manejo ou alto parasitismo intestinal, há a proliferação do microrganismo com a consequente produção de potentes toxinas que provocam a morte do animal. Dentre as toxinas principais destaca-se a toxina alfa, importante fator de virulência, produzida por todos os tipos de C. perfringens, sendo os pertencentes ao tipo A os maiores produtores. A fim de caracterizar o microrganismo em suspeitas de enterotoxemia em ruminantes, trabalhamos com 61 amostras de intestino delgado de bovinos e 12 de ovinos como grupo estudo e no grupo controle composto de animais hígidos levados ao abate, 73 amostras de intestino delgado de bovinos e 24 de ovinos. Foram realizados procedimentos de isolamento e tipagem molecular de C. perfringens e quantificação celular, detecção molecular da toxina &beta;2, além de avaliações moleculares qualitativa (PCR convencional) e quantitativa (PCR em tempo real) do gene da toxina alfa dos diferentes isolados. Em 29 amostras do grupo estudo bovino (47,54%) e em 4 (33,33%) do grupo estudo ovino isolou-se o microrganismo, em contrapartida no grupo controle bovino não houve isolamento do bacilo e 5 amostras do grupo controle ovino (20,83%) foram positivas. Houve diferença estatisticamente significante somente entre os grupos de bovinos (p<0,05). Todos os isolados (100%) foram classificados como tipo A, e os resultados das quantificações celulares de C. perfringens revelaram que todos os bovinos controle apresentaram <10 UFC/g de conteúdo enquanto que o grupo estudo apresentou mediana de 104 UFC/g com variações de <10 UFC/g até 108 UFC/g. Nos ovinos, a mediana no grupo controle foi 101 UFC/g assim como no grupo estudo, entretanto com clara separação de valores entre os grupos. Tanto na PCR convencional quanto na PCR em tempo real para detecção do RNAm da toxina alfa foi observado limiar de detecção de 102 cópias de cDNA por reação, porém provavelmente devido aos valores das amostras estarem próximos ao limite da sensibilidade analítica da reação, não foi observada boa reprodutibilidade da última. Já na reação molecular convencional, observou-se a presença de detecção de RNAm da toxina alfa em 60,52% dos isolados o que revela alguma diferença da presença do transcrito entre as culturas, já que nas cepas restantes não foi detectada a presença do RNAm em questão. A pesquisa do gene da toxina &beta;2 revelou sua presença em 54,55% dos isolados de C. perfringens corroborando com a afirmativa de que o gene está amplamente distribuído entre os ruminantes. A metodologia aplicada para avaliação da expressão do gene da toxina alfa nos isolados mostrou que há diferenças dos níveis de transcrição porém não permitiu quantificar esses valores. A tipagem molecular corrobora com outros estudos quanto à importância epidemiológica do tipo A nos quadros de enterotoxemia em ruminantes, e os dados da quantificação celular permite-nos concluir que animais sadios possuem um nível basal de C. perfringens <10 UFC/g de conteúdo que não possibilita o seu isolamento.