Clonagem do cDNA que codifica a enzima mio-inositol oxigenase (EC 1.13.99.1) de Arabidopsis thaliana e modulação da expressão do gene via anti-sense em plantas de Nicotiana tabacum L.

• Autor(a) principal: Nascimento, Daniela Defávari do
• Data de Publicação: 2005
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20200111-122201/
• topic: ÁCIDO GLUCORÔNICO; CLONAGEM; DNA COMPLEMENTAR; EXPRESSÃO GÊNICA; FUMO; MIO-INOSITOL OXIGENASE; PLANTAS TRANSGÊNICAS

Muitos dos açúcares precursores de hemiceluloses, como UDP-arabinose, UDP-xilose, ácido UDP-galacturônico, UDP-apiose e derivados metilados são provenientes de um precursor comum, o UDP-glucuronato. A síntese de UDP-glucuronato é mediada pela enzima UDP-glicose desidrogenase a partir de UDP-glicose, entretanto, existe uma rota biossintética secundária, a rota de oxidação do inositol, cujos passos regulatórios são pouco conhecidos. A alteração do metabolismo do mio-inositol nas plantas tem despertado grande interesse em razão de sua participação em vários processos metabólicos. Uma vez produzido, o mio-inositol pode seguir várias rotas metabólicas (Loewus & Loewus, 1983) ou ser oxigenado pela enzima mio-inositol oxigenase, formando ácido glucurônico. Essa reação é irreversível e o produto formado pode ser diretamente transferido para a síntese da parede celular ou ser fosforilado pela enzima glucuronoquinase. Este trabalho teve como objetivo clonar o cDNA do gene miox que codifica a enzima mio-inositol oxigenase (EC 1.13.99.1) para modulação da sua expressão, via anti-sense, em plantas de tabaco. A estratégia de clonagem iniciou-se com a busca de genes no banco de dados do NCBI. A seqüência ortóloga da espécie vegetal encontrada, com alto grau de homologia com o gene de Sus scrofa (primeira espécie a ter o gene seqüenciado e caracterizado) foi a de Arabidopsis thaliana. Assim, a seqüência de nucleotídeos dessa, foi utilizada para a confecção dos primers para a ORF do gene da mio-Inositol oxigenase, contendo a sequência de direcionamento CACC no primers 3’ (para clonagem direcional anti-sense do gene). Realizou-se o isolamento do gene miox de A. thaliana através da extração de mRNA desta espécie, que foi em seguida, submetido a reação de RT-PCR com primers específicos para a ORF do gene. Esse produto da reação RT-PCR foi usado como sonda na análise de Southern blot e para clonagem do gene. Para a clonagem, foi necessário primeiro clonar o produto da reação RT-PCR no vetor TOPO seguida de transformação química de células competentes de Escherichia coli (TOP 1 O). Em seguida, procedeu-se a reação LR clonasse para clonagem no vetor binário de transformação de plantas (Gateway - Invitrogen), seguido de transformação química de células competentes de E. coli (DH5oc). A transfomação da linhagem EHA105 de Agrobacterium tumefaciens, com o plasmídio Gateway recombinante (pK7WG2D/anti-sense-miox) foi feita por eletroporação e os clones recombinantes foram selecionados. A transformação de plantas de tabaco foi realizada por infecção de discos foliares com o clone de A. tumefaciens (EHA105) que contém o transgene. A confirmação da presença do transgene nos brotos transformantes foi feita por análise de PCR, com primers do gene nptll, de resistência à canamicina. Essas plantas transgénicas foram cultivadas, sob condições de ambiente controlado, para produção de sementes e posterior avaliação da progênie, quanto à segregação do gene de resistência à canamicina. A expressão do transgene na progênie T2, foi avaliada por Northern blot e através de quantificação dos componentes da parede celular, como carboidratos, lignina e ácidos urônicos. A expressão do gene miox anti-sense das plantas transgénicas causou acúmulo de arabinose e de ácido glucurônico no caule destas plantas.