Estudo das interações entre enzimas e polímeros: efeito do poli(etileno glicol) na atividade e na conformação estrutural de enzimas. Adsorção de enzimas sobre superfícies sólidas

• Autor(a) principal: Pancera, Sabrina Montero
• Data de Publicação: 2006
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46132/tde-26102006-135420/
• topic: Adsorption; Atomic force microscopy; Biomoléculas; Biomolecules; Creatina fosfoquinase; Creatine phosphokinase; Elipsometria; Ellipsometry; Hexokinase; Hexoquinase; Microscopia de força atômica; Polietileno glicol; Polyethylene glycol; SAXS; SAXS

Este trabalho visou investigar as interações entre enzimas e polímeros em solução e a adsorção das mesmas sobre superfícies sólidas e para isto foi dividido em duas partes distintas. Na primeira parte a influência do poli(etileno glicol) (PEG), polímero considerado inerte e utilizado em muitos processosbiotecnológicos, na atividade enzimática e na conformação estrutural de enzimas foi estudada através de medidas de espectrofotometria- UV, calorimetria e espalhamento de raio-X de baixo ângulo (SAXS). Foram escolhidas neste estudo as enzimas glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PDH) e hexoquinase (HK), que são enzimas largamente aplicadas em análises clínicas na determinação de glicose no sangue, e também a enzima álcool desidrogenase (AD), utilizada para determinação de concentração de álcool. Foram obtidos resultados quantitativos, numa faixa de baixa concentração de enzima, que indicam uma forte influência de PEG na atividade das enzimas estudadas. Medidas de calorimetria revelaram que PEG interage não só com a enzima em estudo mas também com a coenzima NADP+. Numa faixa de concentração maior, os resultados de SAXS mostraram que PEG exerce também um efeito significativo no processo de agregação das enzimas. Acima de tudo, foi evidenciado neste estudo que PEG não pode ser tratado como um polímero inerte, pois ele interfere na atividade e conformação de enzimas. As enzimas são macromoléculas complexas e PEG interage de forma diferenciada com cada enzima, merecendo atenção especial caso a caso. Na segunda parte do trabalho, o estudo da adsorção de hexoquinase (HK) e creatina fosfoquinase (CPK) sobre lâminas de silício foi realizado através de medidas de ângulo de contato, elipsometria in situ e microscopia de força atômica (AFM) em água. A CPK é uma enzima bastante utilizada em kits de determinação de creatina no sangue e no diagnóstico de desordens musculares. Este trabalho revelou que o mecanismo de adsorção de CPK sobre silício depende fortemente do pH. Em pH 4, 7 ou 9 CPK adsorveu mantendo a mesma conformação que tinha em solução. Medidas de espectrofotometria UV-Vis revelaram uma mudança no pH ótimo para atividade enzimática de CPK de 6,8 para 9 após adsorção. A HK imobilizada em esferas de vidro mostrou atividade maior do que HK imobilizada nas placas. A reutilização das esferas e placas recobertas com HK foi testada e observou-se que as atividades das enzimas adsorvidas no substrato esférico foram mantidas. Entretanto, nas placas revestidas a atividade foi perdida. As enzimas imobilizadas sobre esferas puderam ser reutilizadas pelo menos 3 vezes, mantendo a atividade por um período de até 3 semanas.