Desenvolvimento e validação de um novo método de citometria de fluxo para a quantificação do conteúdo de hemoglobina fetal em glóbulos vermelhos e sua potencial aplicação clínica na doença falciforme

• Autor(a) principal: Arrojo, Maria Luiza
• Data de Publicação: 2024
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-13052024-152548/
• topic: Citometria de fluxo; Doença falciforme; Fetal hemoglobin; Flow cytometry; Hematologia; Hematology; Hemoglobina fetal; Sickle cell disease

A base do tratamento da DF continua sendo a hidroxiuréia, a qual induz a HbF, que inibe a polimerização da HbS mutante e a consequente falcização. Porém, os exames laboratoriais que avaliam a indução da HbF não permitem quantificar a % de GVs efetivamente protegidos (%GVprot), i.e. aqueles com conteúdo de HbF (cHbF)>10pg/GV. Enquanto a cromatografia (HPLC) determina a % de HbF dentre a Hb no sangue (%HbF), a citometria de fluxo clássica (CFc) fornece a % de GVs HbF+ (%Fcell), incluindo GVs com pouquíssima HbF. Desenvolvemos um método inédito de CF quantitativa (CFq) que utiliza um controle celular interno, composto por amostras de sangue de cordão umbilical (SCU) e de adulto com os conteúdos médios de HbF (MCHbF) conhecidos, permitindo que a distribuição de cHbF/GV na população seja determinada, incluindo a %GVprot. Objetivo. Validar o método e demonstrar seu potencial aplicação clínica na DF. Métodos. O MCHbF de 9 amostras de SCU foram pré-calculados, multiplicando a %HbF pelo respectivo MCH obtido com um analisador hematológico, e comparados com o MCHbF derivado por CFq, de forma a avaliar a correlação e a linearidade do método. Um total de 40 amostras de 29 pacientes com DF (SS) tiveram seus dados hematimétricos e a %GVprot determinados. Destas, foram obtidas a %Fcell (n=27) e a %HbF (n=15), totalizando 12 amostras caracterizadas por todos os métodos, os quais foram avaliados quanto à correlação entre si e com os dados hematimétricos. A Hb foi utilizada para dividir as 27 amostras entre pacientes com baixo (n=9) ou alto (n=18) risco clínico (Hb<9/dL), e a capacidade da %Fcell e da %GVprot em predizer corretamente os pacientes de alto risco foram comparadas com base na área sob a curva ROC (AUC). Resultados. Os valores de MCHbF derivados por CFq das amostras de SCU se correlacionaram significativamente com os pré-calculados (Pearson r=0,83; p=0,002). Das 12 amostras de pacientes caracterizadas por todos os métodos, as 10 com %HbF>10% tiveram %Fcell>99%. Em contraste, a %GVprot se correlacionou fortemente e de forma linear ao longo de todas as %HbF (r=0,89; p<0,0001). Em linha, tanto a %HbF como a %GVprot apresentaram correlações significativas positivas com o No de GVs (RBC), Hb, e hematócrito (Ht), e negativas com a % de reticulócitos (%Ret) e com a amplitude de distribuição dos GVs (RDW); porém, %Fcell se correlacionou apenas com Ht. Digno de nota, foram identificadas tanto amostras com %HbF similares e %GVprot diferentes, como o inverso, destacando a capacidade exclusiva do método CFq de avaliar os diferentes padrões de distribuição do cHbF na população de GVs destes pacientes. Ao considerar as 27 amostras avaliadas quanto à %Fcell, esta se correlacionou apenas com Hb e RDW (adicionalmente), porém, a %GVprot se correlacionou (adicionalmente) positivamente com MCHC, e negativamente com No de GBs (WB), No de Ret (Ret abs), e % de Ret imaturos (IRF). Finalmente, o potencial da %GVprot de predizer os pacientes com alto risco foi muito superior (AUC=0,969 e p<0,0001) à da %Fcell (AUC=0,873 e p=0,0019), com uma sensibilidade de 94,4% e uma especificidade de 88,9%, considerando %GVprot<65% como valor de corte.