Clonagem e expressão das proteínas recombinantes NS1 e NS3 do vírus da dengue tipo 3

• Autor(a) principal: Oliveira, Anibal Silva de
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-21062013-141504/
• topic: clonagem; Cloning; Dengue Virus; expressão; expression; NS1; NS1; NS3; NS3.; proteínas recombinantes; recombinant proteins; Vírus da dengue

A dengue é uma doença infecciosa com grandes taxas de morbimortalidade, causada pelo vírus da dengue (DENV). Segundo a Organização Mundial de Saúde, cerca de 50 a 100 milhões de pessoas são infectadas anualmente em mais de 100 países tropicais e subtropicais de todos os continentes. O espectro clínico da infecção pelo DENV pode incluir formas assintomáticas ou sintomaticas que variam desde uma febre indeterminada e autolimitada, passando pela febre clássica da dengue (FD) até quadros graves denominados febre hemorrágica da dengue/síndrome do choque da dengue (FHD/SCD). Recentemente, ocorreu um dramático aumento do número de casos de FHD/SCD nas Américas, e este aumento coincidiu com a introdução do dengue sorotipo 3, genótipo III. No presente trabalho, objetivou-se a clonagem e a expressão das proteínas NS1 e NS3 do vírus da dengue tipo 3. As proteínas NS1 e NS3 do DENV-3 foram clonadas e expressas com sucesso em sistema procarioto. A amplificação dos genes das proteínas NS1 e NS3 foi realizada por RT-PCR, o qual gerou amplicons de cerca de 1050 e 1850 pb, respectivamente. Em seguida, os genes foram clonados por inserção dos amplicons no vetor plasmidial pCR-XL. Os genes de NS1 e NS3 foram subclonados no vetor de expressão pQE-30 através de sítios de restrição para as enzimas BamHI e HindIII. A expressão proteica foi obtida em sistema procarioto utilizando a cepa BL21(DE3) de E. coli, resultando em proteínas de 45 e 70 kDa as quais foram confirmadas por análises em Western blot utilizando como anticorpo primário fluido ascítico imune de camundongos e soro de pacientes com dengue. Estas proteínas virais podem ser utilizadas para estudos relacionados à patogênese, replicação e mecanismos de escape do sistema imune do DENV, além disso, podem ser potencias antígenos em métodos de diagnóstico.