Investigação da quinase IKKβ como um alvo terapêutico anti-metastático em câncer de pulmão associado à ativação do oncogene KRAS

• Autor(a) principal: Miranda, Vanessa Silva
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-01082019-085027/
• topic: Câncer de pulmão; IKKβ; Kinase; KRAS; KRAS; Lung cancer; Metástase; Metastasis; Quinase IKK&#946

O câncer de pulmão é o tipo de câncer que apresenta o maior índice de mortalidade em todo o mundo. As alterações genéticas mais frequentes em câncer de pulmão são as mutações pontuais no oncogene que codifica a GTPase KRAS. Apesar destas mutações estarem diretamente ligadas à oncogênese, terapias que visam inibir diretamente a proteína Ras falharam em ensaios clínicos. Uma das propriedades mais importantes na oncogênese é a aquisição de capacidade metastática tumoral. Desta forma, o objetivo deste projeto é identificar alvos terapêuticos que inibam as metástases tumorais induzidas pelo oncogene KRAS no pulmão. Com base em relatos recentes mostrando que a forma oncogênica de KRAS promove, não só a iniciação tumoral, mas também promove a aquisição de um fenótipo metastático, a hipótese deste projeto é que (1) a capacidade mestastática tumoral induzida por KRAS no pulmão é potencializada pela quinase IKKβ; e (2) que a inibição desta quinase reduzirá a capacidade invasiva celular e metastática tumoral. Esta hipótese foi formulada com base em estudos anteriores, os quais demonstraram que o principal substrato da IKKβ, o fator de transcrição NF-κB, é ativado por KRAS em tumores pulmonares in situ de forma dependente da IKKβ, que o NF-κB é capaz de promover metástase em diferentes modelos tumorais, e que a inibição da atividade da IKKβ com um inibidor farmacológico em um modelo animal de câncer de pulmão induzido por KRAS, diminui o crescimento tumoral e a progressão tumoral para graus histológicos mais avançados. Nosso objetivo era avaliar se a inibição de IKKβ é capaz de afetar a migração e invasão de células portadoras de mutação em KRAS in vitro e se a inibição de IKKβ é capaz de afetar a capacidade metatática dessas células in vivo. Primeiramente, avaliamos a expressão de enzimas relacionadas ao fenótipo metastático, as metaloproteinases de matriz 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) e, também uma molécula intimamente relacionada ao processo de adesão mediado por integrinas, FAK (quinase de adesão focal), frente a inibição de IKKβ através de um inibidor farmacológico altamente especifico (Composto A) e frente a inibição genética de IKKβ por interferência de RNA (siRNA) em células A549 e H358. Avaliamos também a atividade das MMPs frente inibição genética de KRAS (siKRAS) e IKKβ (siIKKβ) e vimos que IKKβ parece modular a expressão ou atividade de MMP-9 e reduz a expressão de FAK. Já a expressão de MMP-2 não apresentou alteração. Posteriormente avaliamos migração na célula A549 e invasão nas células A549 e H358 com inibição de IKKβ, por ensaios Transwell, e observamos uma redução da migração e invasão celular in vitro. Em seguida, fomos gerar linhagens celulares paraa expressar luciferase, as linhagens A549 pLUC e H358 pLUC. Os clones A549 pLUC B4 e H358 pLUC F1 com inibição de KRAS e IKKβ por interferência de RNA, foram injetados pela veia da cauda nesses camundongos e as metástases foram monitoradas por imageamento in vivo. Houve metástases em 20% dos animais com siIKKβ na região anatômica da boca. Os animais que receberam siControle e siKRAS não apresentaram nenhuma metástase visível no equipamento, mas foi observado micrometástases nas análises histológicas dos pulmões. O resultado do experimento de metástase in vivo é inesperado, não só pelo fato de ocorrer no grupo experimental siIKKβ, mas também pelo local anatômico do tumor, sendo necessária uma maior investigação do papel de IKKβ nesse processo, podendo ser um resultado aleatório. Quando avaliamos em conjunto, nossos resultados sugerem que a quinase IKKβ desempenha um papel importante no fenótipo migratório e invasivo de células pulmonares portadoras de KRAS oncogênica, contribuindo para a capacidade metastática.