Protein-protein interactions involved in copper homeostasis, oxidative aging and neurodegenerative disease

• Autor(a) principal: Sala, Fernanda Angélica
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-20052020-145630/
• topic: ALS, protein crystallography; cristalografia de proteínas; ELA; hCCS; hCCS; heterodimer; heterodímero; hSOD1; hSOD1; modificações pós-traducionais; post-translational modifications

Apesar do conhecimento da importância da Cu,Zn Superóxido Dismutase humana (hSOD1) em muitos processos celulares, pouco é entendido sobre os estágios finais do seu processo de maturação. Estudos ressaltam a importância da proteína auxiliar hCCS (chaperona de cobre humana para superóxido dismutase 1), que reconhece especificamente a hSOD1 recém traduzida e a ativa através da inserção do íon cobre e da oxidação da ligação dissulfeto. Entender esse mecanismo pode ser decisivo na luta contra doenças neurodegenerativas, já que formas imaturas de SOD1 são tipicamente identificadas como mais propensas à agregação. As principais dificuldades desse estudo estão na obtenção de heterocomplexos, já que eles apresentam um caráter transitório e, no comportamento da hCCS que é descrito como recalcitrante à cristalização devido à sua estrutura altamente flexível. Neste trabalho, nosso objetivo foi investigar os processos de reconhecimento e a sequência de eventos de modificação pós-traducionais durante a maturação da hSOD1 catalisada pela hCCS. Experimentos de associação proteína-membrana utilizando diferentes combinações de mutantes de hCCS e SOD1 sugeriram que a aquisição de cobre ocorre via hCCS, em seu estado homodimérico, interagindo com a bicamada lipídica e, subsequentemente formando heterodímeros com hSOD1 fora da membrana. Adicionalmente, utilizando diferentes combinações de mutantes de hCCS e hSOD1 monitoramos a estabilidade dos heterocomplexos ao longo do tempo. Os resultados confirmaram a hipótese de que a formação da ligação dissulfeto é o último passo do processo de maturação do hSOD1 e o regulador da formação do complexo com hCCS. Com base nisso, um conjunto de complexos foi escolhido para os ensaios de cristalização. Os cristais para os heterodímeros foram obtidos usando kits de cristalização comerciais e otimizados usando diferentes técnicas. As estruturas dos heterocomplexos foram obtidas em diferentes estados de metalação para a hSOD1. Nossos resultados mostraram uma nova conformação para o subloop dissulfeto da hSOD1 responsável por regular a formação e dissociação do complexo, comunicar a presença de hCCS ao sítio ativo de hSOD1 e coordenar a dinâmica das mudanças pós traducionais de modo que a transferência de cobre anteceda a formação da ligação de dissulfeto, minimizando a produção de espécies hSOD1 potencialmente tóxicas. Uma vez que a ponte dissulfeto é formada, o heterodímero se dissocia pela presença do grupo metil da hCCS Ala231 que causa repulsão estérica na interface do complexo. Como consequência, a hSOD1 (com o íon cobre e a ligação dissulfeto oxidada) dimeriza para mitigar essa repulsão e, assim, gera as espécies homodiméricas maduras e cataliticamente ativas.