Caracterização biofísica da dinâmica catalítica de uma xilanase GH11

• Autor(a) principal: Molina, Gustavo Avelar
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-17042016-155242/
• topic: Biofísica; Biophysics; Catálise enzimática; Dinâmica molecular; Enzyme catalysis; GH11 xylanase; Molecular dynamics; Xilanase GH11

A dinâmica estrutural fundamentando a função das xilanases GH11 ainda não está clara. Novo conhecimento sobre a dinâmica catalítica dessas enzimas é crucial para a engenharia de novas enzimas melhoradas beneficiando, assim, diversas indústrias biotecnológicas e de química verde. Com base nesse fato, esse trabalho teve por objetivo obter novas informações acerca da dinâmica catalítica de uma xilanase GH11, através do uso de um conjunto de diversas técnicas avançadas de biofísica molecular em nível bulk e em nível de molécula única (inglês single molecule ou sm). Para isso, foram projetadas xilanases GH11 de Bacillus subtilis ssp. subtilis 168 (XynA) com mutações únicas de cisteína para a marcação dos resíduos D119 e R122 no domínio polegar, do resíduo N54 no domínio dedos, e do resíduo N151 na alfa-hélice, seguidas pela sua construção e produção por métodos de biologia molecular. Esses mutantes foram marcados em seus respectivos grupos tióis com a sonda fluorescente sensível à polaridade Acrylodan, com a sonda de spin MTSSL, e com a sonda fluorescente fotoestável AttoOxa11. A xilanase tipo selvagem for marcada em seu N-terminal com a sonda fotoestável Alexa Fluor® 488 5-SDP Ester. Foram utilizados ensaios de espectrofotometria de fluorescência em nível bulk e de espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica para investigar como a dinâmica do domínio polegar da xilanase GH11, temperatura, e ligação ao substrato se correlacionam um com o outro. Os resultados atestaram que um estado do domínio polegar controlado por temperatura, aberto, dinâmico e flexível tem mais chances de se ligar efetivamente ao substrato de uma maneira produtiva, o que está em completo acordo com estudos anteriores de simulação de dinâmica molecular, cristalografia, desnaturação térmica, e análise funcional por desenho racional de mutantes de domínio polegar de xilanases GH11. Com base nas evidências adquiridas e em estudos anteriores, nós propomos um conjunto de hipóteses e modelos para a dinâmica catalítica da xilanase, focando no papel do domínio polegar nesse processo. No intuito de determinar a constante de afinidade da xilanase por seu substrato e os tempos de relaxamento e constantes de velocidade dos movimentos do domínio polegar, foram feitas medidas de espectroscopia de correlação de fluorescência simples e combinada com transferência eletrônica fotoinduzida, usando as xilanases marcadas com as sondas fluorescentes fotoestáveis, na presença e na ausência de substrato. Os resultados mostraram tempos de difusão muito maiores para as xilanases na presença de substrato, como efeito da afinidade da enzima pelo mesmo. Entretanto, não foi verificada nenhuma curva de decaimento como efeito de supressão dinâmica da sonda por PET. Esses mesmos conjugados foram aplicados com sucesso em microscopia por imagem de tempo de vida de fluorescência, no intuito de analisar sistematicamente a afinidade da xilanase por partículas insolúveis e filmes de substrato, e por fragmentos insolúveis de frações de processos de deslignificação e desestruturação de bagaço de cana-de-açúcar, assim como para a análise da composição, estrutura e topologia desses materiais. Foi possível verificar a presença de xilano na maioria das frações desse bagaço tratado, mas em quantidades variáveis