RNAs não-codificantes associados a IS200/605: identificação e caracterização funcional na archaea Halobacterium salinarum NRC-1

• Autor(a) principal: Gomes Filho, José Vicente
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-17042018-163626/
• topic: Archaea; Archaea; Elementos móveis; Insertion sequences; Mobile elements; Non-coding RNAs; RNA-seq; RNA-seq; RNAs não-codificantes; Sequências de inserção

Os elementos genéticos móveis (mobile genetic elements MGEs), são elementos extremamente importantes para plasticidade e evolução dos genomas. Uma das classes mais importantes de MGEs são as sequências de inserção (insertion sequences - IS). Estes elementos são encontrados em bactérias e archaea e apresentam grande diversidade de famílias e mecanismos de movimentação. Uma família interessante de IS é IS200/605, esta família encontra-se distribuída em bactérias, archaea e vírus e utiliza substratos de DNA de fita simples para seu processo de transposição. Neste trabalho, através da análise de dados públicos de transcritoma identificamos RNAs sobrepostos ao 3\' de genes tnpB de IS200/605 em archaea e bactérias, estes transcritos foram chamados de sense overlapping transcripts (sotRNAs). As extremidades 5\' e 3\' dos sotRNAs foram mapeadas através de dados de RNA-seq de pequenos RNAs (sRNA-seq) e validadas através da técnica de C-RACE. Análises de sequência e estrutura secundária demonstraram que estes RNAs apresentam um motivo conservado chamado de RE-like. Utilizando a sequência consenso deste motivo pudemos identificar RNAs intergênicos derivados de IS200/605 em H. salinarum NRC-1. Para caracterização funcional, construímos linhagens superexpressando os RNAs VNG_sot0042 e VNG_R0052, ambos contendo o motivo RE-like. Curvas de crescimento, utilizando as linhagens construídas demonstraram que a superexpressão destes RNAs aumenta o crescimento de H. salinarum demonstrando sua funcionalidade. Devido a presença do motivo RE-like, extremidades 5\' e 3\' determinadas e fenótipo visualizado em curva de crescimento padrão, o sotRNA VNG_sot0042 foi estudado mais a fundo. Realizamos experimentos de RNA-seq para avaliar o impacto desta superexpressão no transcritoma de H. salinarum NRC-1, assim como experimentos de SILAC para identificação de proteínas parceiras em larga escala. Nestes ensaios identificamos proteínas e genes associados ao processo de adesão, geração de células persistentes e resistência a metais pesados. Ensaios de adesão e sobrevivência a metais pesados demonstraram que a linhagem de superexpressão apresenta maior capacidade de aderir a vidro e maior sobrevivência em diversas condições de estresse. Deste modo, podemos sugerir que ncRNAs derivados de IS200/605 são importantes moléculas regulatórias em H. salinarum NRC-1 e nos ajudam a compreender a manutenção de IS200/605 e seus derivados nos genomas de procariotos.