Produção de L-asparaginase por Escherichia coli BL21 (DE3) recombinante em meio de cultivo proveniente de fonte alternativa de carbono

• Autor(a) principal: Battistelli, Lenise Cristina
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/97/97140/tde-06122022-175647/
• topic: Escherichia; Escherichia; Acid and alkaline pretreatment; Corn cob; Enzymatic hydrolysis; Hidrólise enzimática; Lasparaginase; Lasparaginase; Pré-tratamento ácido e alcalino; Sabugo de milho

A produção biotecnológica de produtos de interesse industrial que utilizem biomassa lignocelulósica como fonte de açúcares solúveis, sob a configuração de uma biorrefinaria, tem mostrado grande potencial nas últimas décadas. Atualmente, as enzimas desempenham um papel predominante nas indústrias em virtude da sua seletividade ao catalisar reações bioquímicas, com destaque para as indústrias farmacêuticas, por exemplo, que cada vez mais buscam medicamentos à base de enzimas. A L-asparaginase (L-asparagina amidohidrolase, EC 3.5.1.1, ASNase) é uma enzima que catalisa a hidrólise de L-asparagina em ácido Laspártico e amônia. Suas aplicações variam desde a indústria de alimentos até a indústria farmacêutica. Pesquisas neste campo focam na produção com maior rendimento a um custo menor. O preço e a disponibilidade de fontes de carbono são fatores-chave para o sucesso econômico dos processos biotecnológicos. Com base em uma plataforma de biorrefinaria, a biomassa renovável pode servir como matéria-prima alternativa na produção de açúcares solúveis para a produção de enzimas como a L-asparaginase. Desta forma, o sabugo de milho é uma alternativa que pode contribuir com estes requisitos servindo como matéria-prima na obtenção de um produto de alto valor agregado. Neste sentido, este trabalho visou obter a Lasparaginase com o uso de hidrolisado celulósico de sabugo de milho (HCSM) como fonte alternativa de carbono utilizando a cepa Escherichia coli BL21 (DE3) recombinante. Inicialmente, o sabugo de milho moído e seco foi pré-tratado sequencialmente por ácido sulfúrico diluído e álcali. A hidrólise enzimática do sabugo de milho pré-tratado sequencialmente por ácido sulfúrico diluído e álcali foi conduzida em frascos Erlenmeyer (125 mL) contendo 50 mL de meio (Tween 80 10% m/m), complexo enzimático Cellic® CTec2 (25,25 FPU/g, tampão citrato de sódio 50 mmol/L) a pH 4,8, sob agitação de 200 rpm em incubadora de movimento rotatório a 50 °C e relação sólido:líquido 1:10 (m/v). Desta última etapa, a fração sólida remanescente apresentou visualmente alteração em sua cor e, após sua hidrólise enzimática, obteve-se um hidrolisado celulósico (HCSM) rico em glicose (92,25 g/L) contendo 5,45 g/L de xilose. Estudou-se a remoção da cor do HCSM com carvão vegetal ativado e obteve-se uma remoção de 100 % de sua cor e 89,34 % de remoção de compostos fenólicos totais sem alteração da concentração de glicose. Em agitador orbital, o crescimento celular de Escherichia coli BL21 (DE3) recombinante e indução da enzima Lasparaginase foi realizado em HCSM não tratado, HCSM tratado com carvão vegetal ativado (HCSM-CA) e concentrado (HCSM-[C]) diluídos numa concentração de 5 g/L de glicose além do meio definido para comparação. A maior atividade de L-asparaginase observada foi no HCSMdiluído (5761,70 U/L) em 24 horas de pós-indução com baixa produção de acetato. Por este motivo, o HCSMd foi utilizado no cultivo em sistema descontínuo-alimentado numa concentração de 27,5 g/L de glicose com alimentação exponencial de fonte alternativa de carbono e com alimentação pós-indução (pH-stat). Ao final do cultivo obteve-se resultados promissores, com uma atividade L-asparaginásica de 116615,8 U/L ou 2028 U/g de célula com concentração celular de 57,5 g/L. Este trabalho contribui para a produção da enzima L-asparaginase, um produto de alto valor agregado sob o conceito de um biorrefinaria.