Estudo estrutural e biofísico de três enzimas da via do folato de microrganismos patogênicos.

• Autor(a) principal: Giudice, João Henrique Pimenta
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-06062018-140141/
• topic: Folate; Folato; Microrganismos patogênicos; Pathogenic microorganism; Resistance; Resistência

Em 2015, de acordo com a Organização Mundial da Saúde, o total de mortes na população humana foi de 52,5 milhões de pessoas, em que as doenças infecciosas mais especificamente, infecções respiratórias - aparecem em terceiro lugar no ranking de causas de morte. No total foram 3,5 milhões de mortes ou 6,7% do total, demonstrando um aumento significativo quando comparado com a pesquisa anterior, realizada em 2011, na qual as doenças infecciosas foram responsáveis por 3,2 milhões ou 5,9% do total. Das doenças infecciosas, podemos destacar a Malária, HIV/AIDS, Hepatite, Tuberculose - que aparece em 8º lugar neste mesmo ranking, e a Hanseníase - que é uma importante preocupação no Brasil. A tuberculose, causada pelo Mycobacterium tuberculosis sendo uma das principais causas de morte por doenças infecciosas na população humana, já apresenta cepas resistentes ao tratamento denominadas Cepas multirresistentes (MDR) e Cepas extremamente resistentes (XDR). Enquanto que a hanseníase, causada pelo Mycobacterium leprae, apesar de não ser letal, causa a invalidez dos portadores e o Brasil possui o segundo maior número de casos desta doença. Outro patógeno de importância médica é a Pseudomonas aeruginosa que causa sérias doenças em pacientes com baixa imunidade, principalmente aqueles em hospitais em especial, pacientes com queimaduras. A via do Folato tem despertado a atenção das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que está via oferece seletividade para estes novos inibidores. Isso se deve ao fato de que o tetrahidrofolato é um componente essencial para os organismos procariotos, e apenas eles, precisam realizar a produção de novo desta substância, enquanto que os eucariotos, o adquirem através da alimentação. Entretanto, o surgimento de cepas resistentes não só reforça a necessidade do desenvolvimento de novos fármacos, mas também a compreensão dos mecanismos de resistências destas cepas. O presente trabalho tem como objetivo obter informações biofísicas e estruturais de três enzimas da via do folato, a 7,8 dihidroneopterina aldolase, dihidropteroato sintase e dihidrofolato redutase. Além disso, esse trabalho teve como objetivo a compreensão do mecanismo de resistência através da indução de mutações nos códons 53 e 55 na enzima dihidropteroato sintase (DHPS), caracterização estrutural preliminar da enzima DHNA e estudos estruturais da enzima DHFR em complexo com cicloguanil. Assim, neste trabalho foi realizado a clonagem gênica da região codificando do gene para a enzima DHNA e expressão da proteína recombinante, purificada e utilizada em ensaios biofísicos. Além disso a mutagênese sítio dirigida foi feita com o intuito de se produzir DHPSs mutantes (T70S e P72R), na qual foram utilizadas nos ensaios de ITC, fluorescência, e cristalização, o que possibilitou demonstrar que a resistência de M. leprae às sulfas pode ser devido a troca de uma prolina por uma arginina na posição 72. Por fim, para DHFR, foi possível obter sua estrutura em complexo com cicloguanil que possibilitou avaliar as diferenças estruturais entre a forma aberta e fechada desta enzima. Além disso, confirmamos que o grupo nicotidamida tem essencial importância para a interação com os ligantes.