Avaliação do papel funcional de proteínas da família HtrA de Leptospira interrogans

• Autor(a) principal: Daroz, Brenda
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-29112022-102012/
• topic: Leptospira; Leptospira; HtrA; HtrA; leptospirose; leptospirosis; pathogenesis; patogênese

A leptospirose é uma zoonose de importância global recentemente incluída na lista das Doenças Tropicais Negligenciadas, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. Os roedores desempenham o papel de principais reservatórios da doença em centros urbanos por permitirem a colonização das leptospiras nos túbulos renais proximais e as excretarem vivas na urina. Segundo a Organização Mundial da Saúde, o número de casos clínicos anuais no mundo permanece subestimado, principalmente por causa do amplo espectro de sintomas inespecíficos que o paciente pode apresentar além de um ineficiente diagnóstico, sobretudo na fase inicial da doença. Não há vacina eficaz até o momento. A identificação de proteínas da membrana externa conservadas entre estirpes patogênicas é o principal alvo de pesquisa para elucidar os mecanismos de patogenicidade. São estas proteínas que, provavelmente, estão envolvidas na interação das leptospiras com o ambiente externo, podendo também servir de alvo para o sistema imune do hospedeiro. Algumas espiroquetas se utilizam de proteases de membrana externa como um mecanismo de disseminação por tecidos do hospedeiro. Neste sentido, o projeto propõe a clonagem e expressão de três proteínas preditas como sendo do tipo HtrA (do inglês High Temperature Requirement A), uma importante família de proteases, identificadas por bioinformática no genoma de L. interrogans. Os genes que codificam estas proteínas, LIC11111, LIC11112 e LIC20143, foram amplificados a partir do DNA genômico e o inserto clonado em vetor de expressão em Escherichia coli; então as proteínas foram purificadas e utilizadas para realização dos experimentos. Foram avaliados (a) atividade de imunogenicidade das proteínas em modelo animal, (b) reatividade das proteínas recombinantes frente a soros de pacientes diagnosticados com leptospirose, (c) interação dessas proteínas com macromoléculas do hospedeiro (d) conservação frente a diferentes estirpes de Leptospira e (e) atividade enzimática das proteínas. Construções da LIC11111, LIC11112 e LIC20143 fusionadas com os promotores fortes e constitutivos dos genes lipL32 e lipL21 de L. interrogans foram feitas para transformar L. biflexa sorovar Patoc e avaliar o possível ganho de função na bactéria saprofítica.