Nocaute de LEKTI, através da utilização de CRISPR/Cas9, em linhagem de queratinócito imortalizado

• Autor(a) principal: Vieira, Gabriel Viliod
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-15102018-104517/
• topic: CRISPR; CRISPR; HNSCC; HNSCC; LEKTI; LEKTI

O carcinoma de cabeça e pescoço (HNSCC) é um dos tipos de câncer que mais acomete as pessoas ao redor do mundo, sendo responsável por 300 mil mortes anualmente. Essa alta taxa de mortalidade está diretamente associada ao diagnóstico tardio, ausência de biomarcadores e tratamento inespecífico. Diversos estudos mostraram que a expressão desregulada da classe de serino proteases do tipo II está intimamente relacionada com a etiologia de diversos tipos de carcinomas, como é o caso da via proteolítica da matriptase. Ainda, a matriptase, no contexto normal da descamação epitelial, ativa as KLKs 5 e 7, as quais são inibidas por LEKTI. A proteína LEKTI, codificada pelo gene SPINK5, possui 15 domínios diferentes, os quais são secretados de forma individual para a matriz extracelular, onde participa da inibição das KLKs 5 e 7. Resultados ainda não publicados do nosso laboratório mostraram que LEKTI é capaz de inibir o fenótipo pré-maligno causado pela superexpressão da matriptase na camada basal do epitélio de camundongos, quando superexpresso nessa mesma região. Ainda, marcações imunohistoquímicas de LEKTI, em amostras de carcinomas orais de humanos, mostraram que essa proteína está também presente nos carcinomas de cabeça e pescoço. Dessa forma, a hipótese levantada neste estudo é a de que LEKTI possui papel inibitório durante a carcinogênese de cabeça e pescoço. Sendo assim, para testar nossa hipótese, a presente dissertação buscou nocautear LEKTI, por meio da tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas9, em linhagens de queratinócito imortalizado, através da dissecção por biologia celular, da função de LEKTI nestas células. Os resultados, obtidos por meio de Western Blot, imunofluorescência e sequenciamento das células potencialmente nocauteadas, mostram as dificuldades e desafios de nocautear células hipotetraplóides, como é o caso da linhagem celular utilizada neste estudo.