Expressão da glicoproteína G (RVGP) e proteína de matriz (M) do vírus da raiva utilizando baculovírus recombinante

• Autor(a) principal: Bernardino, Thaissa Consoni
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-25092023-113416/
• topic: Virus-Like Particles; Virus-Like Particles; Baculovírus recombinante; Glicoproteína do vírus da raiva; Proteína de Matriz do vírus da raiva; Rabies envelope glycoprotein; Rabies matrix protein; Recombinant Baculovirus

A raiva é uma doença zoonótica antiga e ainda hoje causa a morte de mais de 60.000 pessoas em todo o mundo a cada ano. O vírus da raiva codifica 5 proteínas, entre elas a glicoproteína (RVGP) e a proteína de matriz (RVM). A RVGP é a única proteína exposta na superfície da partícula viral e é mediadora da adesão e entrada do vírus na célula hospedeira, e tem a capacidade de induzir resposta imune com formação de anticorpos neutralizantes. Já a proteína de matriz tem sido descrita com inúmeras funções, entre elas, está a sua capacidade de auxiliar no processo de produção de partículas semelhantes a vírus (VLPs). As VLPS têm sido produzidas em diferentes sistemas de expressão, como o sistema de baculovírus recombinantes. Esse sistema tem se destacado para a produção e expressão de proteínas heterólogas. Para este trabalho, nós construímos dois bacmídeos recombinantes portadores dos genes da RVGP e RVM. Esses bacmídeos foram utilizados para transfectar células Sf9, para a produção dos lotes virais. Os lotes virais foram titulados utilizando células SF9 Easy Titer . A partir dos ensaios de infecção e coinfecção nós padronizamos o melhor MOI e o tempo de coleta das VLPs. O sobrenadante celular foi coletado, concentrado e purificado por gradiente de sacarose. Cada etapa foi utilizada para detecção das proteínas por imunoensaios, como dot blot, western blot e ELISA (para a RVGP). Utilizando o gradiente de sacarose com frações de 10, 30 e 50% foi possível verificar a separação das VLPs dos BVs recombinantes. Através da técnica de contrastação negativa visualizamos estruturas que se assemelham a VLPs de raiva, produzidas em células de inseto, assim como também observávamos os BVs recombinantes. Vale ressaltar que as VLPs e os BVs foram detectados em diferentes frações do gradiente de sacarose. Com a utilização do ELISA para dosar a RVGP total conseguimos verificar a eficiência de recuperação das VLPs em cada etapa do processo de purificação. Esses dados nos permitiram concluir que obtivemos uma boa produção de lotes com altos títulos virais; através das técnicas de imunodetecção observamos as proteínas no tamanho esperado, tanto na infecção quanto na coinfecção; os métodos para purificação das VLPs necessitam ser otimizados, porém o gradiente de sacarose nos mostrou ser eficiente para a separação das VLPs dos BVs recombinantes.