Desenvolvimento de um método rápido de identificação, ao nível de espécie, de Lactobacillus e Saccharomyces em dornas de fermentação, por meio da técnica de MALDI-TOF MS: validação molecular e construção do banco de dados espectral

• Autor(a) principal: Fonseca, Juliana Guimarães
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-16082019-105112/
• topic: Fingerprinting; Bactérias ácido lácticas; Espectrometria de massas; Fingerprinting; Genes housekeeping; Housekeeping genes; Lactic acid bacteria; Mass spectrometry

O gênero Lactobacillus é o principal grupo de bactérias contaminantes em dornas de fermentação para produção de etanol em larga escala. A alta proliferação destes microrganismos prejudica a viabilidade de cepas de Saccharomyces cerevisiae selecionadas, podendo diminuir a produção de etanol nas dornas de fermentação. Os métodos mais utilizados para identificação destes microrganismos são bioquímicos e moleculares baseados na sequência do DNA, que são muito demorados, onerosos e muitas vezes remetem a resultados ambíguos. MALDI-TOF MS é uma poderosa ferramenta de identificação microbiana e foi testada neste trabalho para identificação de diferentes isolados de Lactobacillus e S. cerevisiae presentes no processo de produção de etanol. Os métodos de preparo e aplicação da amostra para aquisição espectral foram estabelecidos, tanto para bactérias quanto para leveduras. Vinte e sete isolados de Lactobacillus foram identificados pela região 16S rDNA e dois genes housekeeping, pheS e groEL e, três cepas de leveduras selecionadas do processo foram identificadas pela região ITS e 28S nr-LSU. As identificações genômicas foram contrastadas com as identificações obtidas com o perfil proteico por MALDI-TOF MS e 97% dos Lactobacillus tiveram a mesma classificação molecular que o gene pheS, eleito como o mais discriminatório, e 100% das cepas de leveduras foram classificadas como S. cerevisiae por ambas as técnicas. A técnica MALDI- TOF MS se mostrou altamente eficiente para discriminação intraespecífica de leveduras e interespecífica de Lactobacillus, não havendo apenas discriminação para isolados classificados como L. casei pelos genes housekeeping. Além disso, quando comparado o poder discriminatório da técnica MALDI-TOF MS em relação ao banco de dados espectral disponível no Biotyper e, posteriormente, ao banco de dados complementar criado neste trabalho com os microrganismos próprios do processo de produção de etanol, houve um aumento de 57 a 100% das repetições que foram identificadas ao nível de espécie com alta confiabilidade. Desta forma, os resultados deste estudo mostraram que a técnica MALDI-TOF MS pode ser utilizada como uma alternativa rápida e eficaz para identificação de Lactobacillus e Saccharomyces do processo etanólico.