Estrutura cristalográfica da enzima triosefosfato isomerase de Bacillus stearothermophilus e desenho racional de drogas contra a doença do sono

• Autor(a) principal: Delboni, Luis Fernando
• Data de Publicação: 1995
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-06122013-142443/
• topic: Cristalografia de proteínas; Drug design; Estabilidade térmica de proteínas; Planejamento de fármacos; Protein crystallography; Protein termal stability

O atual crescimento do número de estruturas tridimensionais de proteínas está produzindo um banco de dados de estruturas que é muito útil como ponto de partida para o desenvolvimento de novas moléculas relevantes do ponto de vista médico tais como drogas e vacinas. Neste trabalho, parte do projeto de desenvolvimento de novas drogas contra a doença do sono foi feita baseada nos estudos cristalográficos de ligação de compostos e de modelagem molecular de duas enzimas glicolíticas presentes no glicossomo de T. brucei. Como o alvo para novas drogas e o ciclo de glicólise, o qual também é presente nos seres humanos, o novo ligante deve ser seletivo. Frutose-1,6-bisfosfato aldolase (ALDO) é uma das proteínas alvo para o desenho racional de drogas. A análise estrutural e estudos cristalográficos da ALDO de T. brucei foram feitos, através do uso de proteína produzida em grandes quantidades por via recombinante. Vários possíveis sítios de seletividade foram encontrados em ALDO de T. brucei quando comparada as três seqüências das isoenzimas humana, tendo como base a estrutura tridimensional da isoenzima ALDO A. O braço flexível da região C-terminal é um forte alvo para compostos seletivos devido a não-conservação das seqüências. Cristais foram crescidos e padrões de difração de raios-X foram obtidos até 3.0&#197, mas ainda os cristais são pequenos e mostram-se sensíveis a radiação. Triosefosato isomerase (TIM) é outra ptoteína alvo analisada neste trabalho. A estrutura da TIM de T. brucei é conhecida a alta resolução. Cristais de proteína expressa em bactérias foram obtidos após extensivos experimentos. Foi identificado que usar proteína recentemente preparada é essencial para obter cristais que apresentem boa qualidade de difração. Depois de obtidos cristais de proteína expressa em grades quantidades, foram feitos experimentos de difusão de novos inibidores, coleta de dados de difração e análises das estruturas dos possíveis complexos. A conhecida estrutura em volta flexível da TIM fecha quando se liga o substrato ou um inibidor análogo ao substrato no sítio ativo. Desenho racional de drogas tem sido seguido usando como padrão a conformação fechada da estrutura em volta. No entanto, com a obtenção de um novo complexo, no qual a estrutura em volta adota a conformação aberta foi feita uma busca de novos compostos em bancos de dados, que não fossem derivados de fosfatos e fosfoantos, através do programa DOCK. Com este procedimento são propostos novos compostos guia os quais serão utilizados no ciclo do desenho racional de drogas. A estrutura da triosefosfato isomerase de Bacillus stearothermophilus que apresenta estabilidade térmica em complexo com o inibidor competitivo 2PG foi determinada por cristalografia de raios-X à resolução de 2.8&#197. A estrutura foi resolvida por substituição molecular usando o programa XPLOR. Promediação da densidade eletrônica de ordem dois e nivelamento do solvente foram aplicados para melhorar a qualidade do mapa. Ambos os sítios ativos estavam ocupados pelo inibidor e a estrutura emvolta flexível adota a conformação fechada em ambas as subunidades. O fator cristalográfico R é de 17,6% com boa geometria. Bacillus stearothermophillus é considerado um organismo de estabilidade térmica moderada. Encontram-se disponíveis cinco estruturas de triosefosfato isomerase de organismos mesofílicos. A estrutura obtida neste trabalho é a primeira TIM reportada que apresenta estabilidade térmica. Vários artigos têm listados fatores de estabilidade térmica, os quais foram analisados em todas as estruturas de TIM disponíveis. Neste trabalho foi conduzida uma comparação entre a estrutura termofílica e as mesofílicas disponíveis, da qual se concluiu que a interação hidrofóbica na formação do dímero, e o alto número de prolinas são os mais importantes fatores que contribuem para a estabilidade térmica da TIM de B.stearothermophilus. Também concluiu-se que a razão Arg/(arg+Lys) é elevada em TIM de B. stearothermophilus mais devido ao baixo número de lisinas do que a um alto número de argininas. Analisou-se as argininas na TIM de B. stearothermophilus como também as interações das argininas e lisinas em todas as outras estruturas de TIM e não foi possível relacionar o valor aumentado da razão Arg/(arg+Lys) com a estabilidade térmica, fator este indicado anteriormente como importante para a estabilidade térmica