Minimização da estrutura da DisBa-01, uma desintegrina com potenciais atividades anti-trombótica e anti-metastática

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Gonçalves, Daniele Fernanda Chiarelli
Data de Publicação: 2008
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-12052008-185026/
Resumo: A DisBa-01, uma desintegrina RGD recombinante ainda não isolada do veneno de Bothrops alternatus, exibe alta afinidade pela integrina aIIbB3, contribuindo para inibição da agregação plaquetária (RAMOS, 2005). DisBa-01 possui também atividades anti-trombótica e anti-metastática comprovadas in vivo (Ramos, 2005). A fim de obter moléculas menores mantendo as atividades da DisBa-01, dois mutantes estão em estudo. Moléculas chamadas DisBa (1-32) e DisBa (1-36) apresentam 32 e 36 resíduos a menos que a DisBa-01, respectivamente, na região N-terminal. Oligonucleotídeos foram construídos e os DNAs foram amplificados por PCR utilizando o plasmídeo pET28a-DisBa-01 como o molde. Os produtos de PCR foram clonados no vetor de expressão pET32a. Análises das seqüências revelaram que os genes e sua fase de leitura estavam completamente corretos. Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em linhagem de E.coli BL21 (DE3). Os plasmídeos recombinantes foram induzidos com IPTG para expressar as proteínas em fusão com a tiorredoxina. As proteínas foram expressas na forma solúvel e com massa molecular coincidente com a previsão. As proteínas de fusão foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina de níquel e clivadas com a enzima enteroquinase. As amostras clivadas foram purificadas por cromatografia de filtração a gel. Os passos de purificação e clivagem foram analisados por SDS-PAGE e reação de immunoblotting utilizando o anticorpo anti-Echistatin. Testes de inibição da adesão celular, usando células de melanoma de camundongo B16F10 ricas em integrina avb3, mostraram que a DisBa (1-32) e a DisBa (1-36) são capazes de inibir, aproximadamente, 70% da adesão celular, um resultado semelhante ao encontrado para a molécula de DisBa-01. Portanto, as duas moléculas mutantes da DisBa-01 obtidas apresentaram atividades que podem ser exploradas no desenho de novos medicamentos contra câncer.
id USP_c67ebebc62b6b440be23fab2767c15cb
oai_identifier_str oai:teses.usp.br:tde-12052008-185026
network_acronym_str USP
network_name_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
repository_id_str 2721
spelling Minimização da estrutura da DisBa-01, uma desintegrina com potenciais atividades anti-trombótica e anti-metastáticaMutantsof disba-01, a disintegrinwith potential antithrombotic and antimetastic activitiesBothrops alternatusBothrops alternatusCancerCâncerDesintegrinaDisBa-01DisBa-01DisintegrinMetalloproteaseMetaloproteaseA DisBa-01, uma desintegrina RGD recombinante ainda não isolada do veneno de Bothrops alternatus, exibe alta afinidade pela integrina aIIbB3, contribuindo para inibição da agregação plaquetária (RAMOS, 2005). DisBa-01 possui também atividades anti-trombótica e anti-metastática comprovadas in vivo (Ramos, 2005). A fim de obter moléculas menores mantendo as atividades da DisBa-01, dois mutantes estão em estudo. Moléculas chamadas DisBa (1-32) e DisBa (1-36) apresentam 32 e 36 resíduos a menos que a DisBa-01, respectivamente, na região N-terminal. Oligonucleotídeos foram construídos e os DNAs foram amplificados por PCR utilizando o plasmídeo pET28a-DisBa-01 como o molde. Os produtos de PCR foram clonados no vetor de expressão pET32a. Análises das seqüências revelaram que os genes e sua fase de leitura estavam completamente corretos. Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em linhagem de E.coli BL21 (DE3). Os plasmídeos recombinantes foram induzidos com IPTG para expressar as proteínas em fusão com a tiorredoxina. As proteínas foram expressas na forma solúvel e com massa molecular coincidente com a previsão. As proteínas de fusão foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina de níquel e clivadas com a enzima enteroquinase. As amostras clivadas foram purificadas por cromatografia de filtração a gel. Os passos de purificação e clivagem foram analisados por SDS-PAGE e reação de immunoblotting utilizando o anticorpo anti-Echistatin. Testes de inibição da adesão celular, usando células de melanoma de camundongo B16F10 ricas em integrina avb3, mostraram que a DisBa (1-32) e a DisBa (1-36) são capazes de inibir, aproximadamente, 70% da adesão celular, um resultado semelhante ao encontrado para a molécula de DisBa-01. Portanto, as duas moléculas mutantes da DisBa-01 obtidas apresentaram atividades que podem ser exploradas no desenho de novos medicamentos contra câncer.DisBa-01, a recombinant RGD-disintegrin still not isolated from B. alternatus venom exhibits high affinity for aIIbB3 integrin, contributing for the inhibition of platelet aggregation (Ramos, 2005). DisBa-01 possesses also antithrombotic and antimetatatic activities in vivo (Ramos, 2005). In order to obtain shorter molecules maintaining activities of DisBa-01 two mutants were studied. Molecules called DisBa (1-32) and DisBa (1-36) have 32 and 36 residues unless DisBa-01, respectively, in the N-terminal region. Oligonucleotides were constructed and the DNAs were amplified by PCR using pET28a-DisBa-01 vector as the template. PCR products were cloned into expression vector pET32a. Sequence analysis showed that reading frames were completely correct. The recombinant plasmids were introduced in BL21(DE3) E.coli strain. The recombinant plasmids were induced with IPTG to express the proteins in fusion with thioredoxin. Proteins were expressed in a soluble form and with molecular mass coincident with prediction. Fusion proteins were purified by affinity chromatography in nickel resin and cleaved with enterokinase enzyme. Samples of cleavage were purified by the gel filtration chromatography. Purification and cleavage steps were analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting reaction using anti-Echistatin antibody. Tests inhibition of cell adhesion, using cells from mice B16F10 melanoma rich in integrin avb3, showed that DisBa (1-32) and DisBa (1-36) are able to inhibit approximately 70% of cell adhesion. Therefore the two mutants molecules of the DisBa-01 obtained in this work present activities that can be explored in the design of new medicines against cancer.Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPSouza, Dulce Helena Ferreira deGonçalves, Daniele Fernanda Chiarelli2008-03-27info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-12052008-185026/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPLiberar o conteúdo para acesso público.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2016-07-28T16:09:55Zoai:teses.usp.br:tde-12052008-185026Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212016-07-28T16:09:55Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false
dc.title.none.fl_str_mv Minimização da estrutura da DisBa-01, uma desintegrina com potenciais atividades anti-trombótica e anti-metastática
Mutantsof disba-01, a disintegrinwith potential antithrombotic and antimetastic activities
title Minimização da estrutura da DisBa-01, uma desintegrina com potenciais atividades anti-trombótica e anti-metastática
spellingShingle Minimização da estrutura da DisBa-01, uma desintegrina com potenciais atividades anti-trombótica e anti-metastática
Gonçalves, Daniele Fernanda Chiarelli
Bothrops alternatus
Bothrops alternatus
Cancer
Câncer
Desintegrina
DisBa-01
DisBa-01
Disintegrin
Metalloprotease
Metaloprotease
title_short Minimização da estrutura da DisBa-01, uma desintegrina com potenciais atividades anti-trombótica e anti-metastática
title_full Minimização da estrutura da DisBa-01, uma desintegrina com potenciais atividades anti-trombótica e anti-metastática
title_fullStr Minimização da estrutura da DisBa-01, uma desintegrina com potenciais atividades anti-trombótica e anti-metastática
title_full_unstemmed Minimização da estrutura da DisBa-01, uma desintegrina com potenciais atividades anti-trombótica e anti-metastática
title_sort Minimização da estrutura da DisBa-01, uma desintegrina com potenciais atividades anti-trombótica e anti-metastática
author Gonçalves, Daniele Fernanda Chiarelli
author_facet Gonçalves, Daniele Fernanda Chiarelli
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Souza, Dulce Helena Ferreira de
dc.contributor.author.fl_str_mv Gonçalves, Daniele Fernanda Chiarelli
dc.subject.por.fl_str_mv Bothrops alternatus
Bothrops alternatus
Cancer
Câncer
Desintegrina
DisBa-01
DisBa-01
Disintegrin
Metalloprotease
Metaloprotease
topic Bothrops alternatus
Bothrops alternatus
Cancer
Câncer
Desintegrina
DisBa-01
DisBa-01
Disintegrin
Metalloprotease
Metaloprotease
description A DisBa-01, uma desintegrina RGD recombinante ainda não isolada do veneno de Bothrops alternatus, exibe alta afinidade pela integrina aIIbB3, contribuindo para inibição da agregação plaquetária (RAMOS, 2005). DisBa-01 possui também atividades anti-trombótica e anti-metastática comprovadas in vivo (Ramos, 2005). A fim de obter moléculas menores mantendo as atividades da DisBa-01, dois mutantes estão em estudo. Moléculas chamadas DisBa (1-32) e DisBa (1-36) apresentam 32 e 36 resíduos a menos que a DisBa-01, respectivamente, na região N-terminal. Oligonucleotídeos foram construídos e os DNAs foram amplificados por PCR utilizando o plasmídeo pET28a-DisBa-01 como o molde. Os produtos de PCR foram clonados no vetor de expressão pET32a. Análises das seqüências revelaram que os genes e sua fase de leitura estavam completamente corretos. Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em linhagem de E.coli BL21 (DE3). Os plasmídeos recombinantes foram induzidos com IPTG para expressar as proteínas em fusão com a tiorredoxina. As proteínas foram expressas na forma solúvel e com massa molecular coincidente com a previsão. As proteínas de fusão foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina de níquel e clivadas com a enzima enteroquinase. As amostras clivadas foram purificadas por cromatografia de filtração a gel. Os passos de purificação e clivagem foram analisados por SDS-PAGE e reação de immunoblotting utilizando o anticorpo anti-Echistatin. Testes de inibição da adesão celular, usando células de melanoma de camundongo B16F10 ricas em integrina avb3, mostraram que a DisBa (1-32) e a DisBa (1-36) são capazes de inibir, aproximadamente, 70% da adesão celular, um resultado semelhante ao encontrado para a molécula de DisBa-01. Portanto, as duas moléculas mutantes da DisBa-01 obtidas apresentaram atividades que podem ser exploradas no desenho de novos medicamentos contra câncer.
publishDate 2008
dc.date.none.fl_str_mv 2008-03-27
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-12052008-185026/
url http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-12052008-185026/
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.none.fl_str_mv
dc.rights.driver.fl_str_mv Liberar o conteúdo para acesso público.
info:eu-repo/semantics/openAccess
rights_invalid_str_mv Liberar o conteúdo para acesso público.
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.coverage.none.fl_str_mv
dc.publisher.none.fl_str_mv Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
publisher.none.fl_str_mv Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
dc.source.none.fl_str_mv
reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
instname:Universidade de São Paulo (USP)
instacron:USP
instname_str Universidade de São Paulo (USP)
instacron_str USP
institution USP
reponame_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
collection Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)
repository.mail.fl_str_mv virginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.br
_version_ 1815256892734177280