Caracterização cinética do fator de transcrição do sistema Ohr/OhrR de Pseudomonas aeruginosa e análise de respostas fenotí­picas e imunológicas

• Autor(a) principal: Guercio, Anita Martins Fontes Del
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41131/tde-13022020-103014/
• topic: Host-pathogen interaction; Interação patógeno-hospedeiro; Ohr/OhrR; Ohr/ohrR; Peróxidos; Peroxydes; Pseudomonas aeruginosa; Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria oportunista de ampla distribuição e que infecta principalmente pacientes acometidos por fibrose cística, pneumonia ou com doenças respiratórias pré-existentes, sendo grande responsável por mortes em UTIs em todo o mundo. Entretanto, os mecanismos de ação envolvidos na determinação da virulência desse microrganismo ainda não estão completamente elucidados. A peroxidase Ohr e seu regulador transcricional OhrR, das famílias Ohr/OsmC e MarR (Multiple antibiotic resistance Regulator), respectivamente, estão envolvidos na defesa antioxidante de bactérias a peróxidos orgânicos e peroxinitrito. No presente trabalho foram investigadas as ações de Ohr e OhrR em interações patógeno-hospedeiro por meio de um modelo de infecção pulmonar aguda em camundongos pela linhagem PA14 de P. aeruginosa, bem como pelos mutantes simples (Δohr e ΔohrR) e o duplo mutante (Δohr/ΔohrR). Foram construídas linhagens mutantes apolares por recombinação homóloga e a verificação fenotípica ocorreu por meio dos testes de Kirby-bauer e MIC (Minimal Inhibitory Concentration), confirmando maior sensibilidade das mutantes Δohr e ohr/ΔohrR quando desafiadas por hidroperóxidos orgânicos em relação à selvagem. Inicialmente, as curvas de sobrevivência de camundongos infectados pelas diferentes linhagens foram determinadas. Não houve diferenças estatísticas significativas entre as linhagens, mas os camundongos infectados pela linhagem ΔohrR demonstraram maior capacidade de sobrevivência, sugerindo a participação de OhrR na virulência da bactéria. Ao mesmo tempo, observamos a morte precoce de camundongos infectados pela linhagem Δohr, apontando que a ausência de Ohr poderia estar interferindo de maneira negativa para o hospedeiro. A baixa virulência da linhagem ΔohrR foi um resultado surpreendente, uma vez que a expressão da peroxidase Ohr está aumentada nesses casos. Também foi inesperado o fato da linhagem Δohr provocar mortes precoces. Diversos parâmetros relacionados à resposta inflamatória de camundongos à infecção pelas distintas linhagens de P. aeruginosa foram analisados. Interessantemente, os camundongos infectados pelas linhagens Δohr e Δohr/ΔohrR apresentaram maior recrutamento de neutrófilos de forma significativa em relação à linhagem selvagem. Os níveis de IL-1β e TNF- α nos pulmões de camundongos infectados pela linhagem Δohr foram maiores do que na linhagem selvagem, embora os valores só tenham sido significativos no primeiro caso. Em geral, os níveis de citocinas foram sempre maiores nos pulmões de camundongos infectados com as linhagens mutantes do que com a linhagem selvagem, embora em muitos casos sem significância estatística. O maior recrutamento de neutrófilos e os maiores níveis de citocinas nos pulmões de camundongos infectados pela linhagem Δohr são sugestivos de resposta inflamatória mais intensa. As análises de citocina dos demais órgãos (fígado e baço), bem como a análise de CFU, não apontaram diferenças estatísticas entre as linhagens, o que é coerente com o fato de P. aeruginosa ser um patógeno que infecta pulmões. Uma outra linha de investigação dessa tese envolveu análises bioquímicas e cinéticas de OhrR recombinante de P. aeruginosa (PaOhrR), já que esse fator de transcrição é considerado o sensor bacteriano de peróxidos orgânicos. As reações de PaOhrR com hidroperóxidos orgânicos foram avaliadas por meio da fluorescência intrínseca de triptofano usando fluorímetro acoplado a equipamento de mistura rápida com fluxo interrompido (Stopped Flow). Dessa forma, as reações de PaOhrR com hidroperóxidos derivados de ácidos graxos procedeu com constantes de velocidade na ordem de 106 M-1.s-1. De maneira semelhante, obtivemos valores na ordem de 105 M-1.s-1 para reações com peroxinitrito. Ao mesmo tempo, confirmou-se a baixa reatividade entre PaOhrR e H2O2, com constantes de velocidade na ordem de 101 M-1.s-1. Também construímos mutantes individuais das três cisteínas presentes em PaOhrR, e assim pudemos determinar que Cys19 é a cisteína catalítica e Cys 121 é a cisteína de resolução. Esses resultados foram confirmados por meio de ensaios cinéticos e de SDS-PAGE não redutor. Isso era esperado, já que esses resíduos são conservados entre várias proteínas OhrR. As constantes de velocidade de oxidação de OhrR de C. violaceum (CvOhrR), também investigadas nessa tese, foram bastante semelhantes às constantes de PaOhrR. As constantes cinéticas de oxidação de CvOhrR por hidroperóxidos orgânicos artificiais e derivados de ácidos graxos situaram-se na ordem de 104 M-1.s-1 e 106 M-1.s-1, respectivamente, portanto, valores similares aos obtidos por PaOhrR. Também determinamos a constante cinética de redução de CvOhrR por tiorredoxina de C. violaceum (CvTrxA), resultando em valores da ordem de 104 M-1.s-1. Em geral, as constantes de reação dos fatores de transcrição OhrR estudados nessa tese, estão de duas a três ordens de grandeza menores do que valores correspondentes para Ohr, determinados previamente por nosso grupo. Esses resultados estão de acordo com a proposição de que OhrR teria um papel na percepção de hidroperóxidos orgânicos, enquanto Ohr teria a função de decompor esses oxidantes. Portanto, os resultados obtidos nesta tese contribuíram para o melhor entendimento dos papeis do sistema Ohr-OhrR na resposta bacteriana a peróxidos orgânicos e possivelmente na compreensão de mecanismos de virulência de P. aeruginosa